高效兼性好氧反硝化細(xì)菌的分離鑒定

高效兼性好氧反硝化細(xì)菌的分離鑒定

1好氧反硝化細(xì)菌的篩選傳統(tǒng)理論認(rèn)為，只有在氧氣條件下才能建立反硝化酶系統(tǒng)（bonintal.1989；ferguson1994），生物反硝化過程可以進(jìn)行。然而，在后來的研究中，一些科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了具有誘導(dǎo)反應(yīng)的細(xì)胞菌，如螺旋體和甲基丙烯酸酯，它們可以在o2條件下反硝化（約瑟夫索頓等人，2002年，喬伊爾安頓等人，2005年）。馬放等人（2005）從活性污染的土壤中分離出厭氧反硝化菌gtx1。在好氧條件下，總氮含量超過50%。suetal（2001）可從sm-3型菌株中分離反硝化反應(yīng)。傳統(tǒng)的污水脫氮處理工藝常表現(xiàn)出脫氮效果不理想,因此,常需要對高濃度的含氮廢水先進(jìn)行稀釋(Jungetal.,2004)和吹脫(王獻(xiàn)平等,2007;陳莉榮等,2007),該工藝處理時間長,費(fèi)用高(Yooetal.1999;Yangetal.2005).而正在研究中的同步硝化反硝化新工藝(SND)則在低氧條件下表現(xiàn)出較好效果,但出水中亞硝態(tài)氮含量可能偏高,反硝化作用也會因碳源不足而受限,很難保持處理過程連續(xù)穩(wěn)定高效進(jìn)行(呂錫武等,2002;張鵬等,2001;呂其軍,2003).好氧反硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn),為污水生物脫氮技術(shù)注入了新的活力,對解決上述問題提供了新的方法.好氧反硝化細(xì)菌克服了傳統(tǒng)的反硝化細(xì)菌只能在缺氧條件下進(jìn)行反硝化作用的缺點(diǎn),有氧生長,生長周期短,對高濃度的氮耐受力很強(qiáng)(Jooetal.,2005;周立祥等,2006),利于縮短廢水脫氮時間,并為同步硝化反硝化作用的工程化提供了可能.但是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化細(xì)菌為數(shù)不多(王宏宇等,2007;黃運(yùn)紅等,2007;Patureauetal.,2000),而高效的好氧反硝化細(xì)菌則更少.為了更早地將好氧反硝化細(xì)菌應(yīng)用于實(shí)際的高氮廢水處理中,篩選分離出在更短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)更高脫氮效率的好氧反硝化細(xì)菌以及對好氧反硝化的理論研究仍然是一項十分迫切的任務(wù).基于好氧反硝化細(xì)菌多數(shù)是兼性細(xì)菌(Fretteetal.,1997;Paietal.,1999;Suetal.,2000),為此本研究分別以水稻土和活性污泥作為分離材料,篩選分離得到兩株高效的兼性好氧反硝化菌,研究了其對高含氮人工配水中氮的脫除效率,以期為其工程應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).2材料和方法表面活性劑2.1好氧反硝化細(xì)菌的分離和澄清2.1.1微量元素和nh3.1分別在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗農(nóng)場和南京鎖金村污水處理廠取新鮮的淹水水稻土樣10g和活性污泥樣10mL,接種于裝有90mL滅菌的反硝化培養(yǎng)液(g·L-1)(周立祥等,2006)(KNO32.0,檸檬酸鉀鈉11.4,MgSO4·7H2O0.2,KH2PO41.0,去離子水1L,pH7.0～7.5,2mL微量元素溶液(Jooetal.,2005)(EDTA·2Na57.1,ZnSO4·7H2O3.9,CaCl2·2H2O7.0,MnCl2·4H2O5.1,FeSO4·7H2O5.0,(NH4)6Mo7O24·4H2O1.1,CuSO4·5H2O1.6,CoCl2·6H2O1.6)的250mL磨口三角瓶中,振蕩2h,待樣品混勻后,添加培養(yǎng)液直至充滿三角瓶為止,蓋上瓶塞,并用石蠟-凡士林封口,28℃靜置培養(yǎng)3d,取菌液5mL接種于新鮮反硝化培養(yǎng)液中,繼續(xù)缺氧條件28℃靜置培養(yǎng)3d,如此重復(fù)操作3次,以富集反硝化細(xì)菌.2.1.2菌株的培養(yǎng)和測定富集完成后,取1mL菌液稀釋涂平板,28℃溫箱培養(yǎng)3d,挑取形態(tài)不同的菌落進(jìn)行分離純化(56株).將分離純化后的菌株接種于裝有5mL的反硝化培養(yǎng)液的試管中,37℃,180r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)3d.吸取少量菌液,參照文獻(xiàn)(李阜棣,1996),滴加格里斯試劑,二苯胺試劑和奈氏試劑,指示培養(yǎng)液中亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、和氨態(tài)氮的變化.通過顯色反應(yīng),挑選對硝態(tài)氮有較強(qiáng)利用效果的菌株接種于反硝化培養(yǎng)基斜面上,在4℃冰箱中保存.將保存在斜面上的菌株在平板(細(xì)菌培養(yǎng)基)上劃線,挑取一環(huán)菌落至反硝化培養(yǎng)液中搖床振蕩培養(yǎng)后,將2%(體積比)處于對數(shù)生長期的菌液接入100mL新鮮的滅菌反硝化培養(yǎng)液中,37℃,180r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)48h,培養(yǎng)期間采用稱重法補(bǔ)充三角瓶中損失的水分.無菌操作,每12h取樣2mL,除總氮測定外,培養(yǎng)液中其余氮素的濃度(硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、氨態(tài)氮)以及總有機(jī)碳(TOC)濃度的變化測定均采用高速離心(12000r·min-1)培養(yǎng)液,去菌體取上清液的方法測定.2.2好氧反硝化細(xì)菌的鑒定2.2.1好氧反硝化細(xì)菌的生化特性參照文獻(xiàn)(東秀珠等,2001),針對上述好氧反硝化作用明顯的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)特征和生理生化特征測定,包括對糖的發(fā)酵狀況,對碳源的要求等,鑒定到屬.采用半固體穿刺法檢測細(xì)菌的需氧性和運(yùn)動性.2.2.2tgactcag-31)目的菌株總DNA的提取參照文獻(xiàn)(奧斯伯FM等,2005),從目的菌株中制備基因組DNA.2)目的菌株16SrDNA的PCR擴(kuò)增及序列測定菌株的16SrDNA的PCR擴(kuò)增測定參照參考文獻(xiàn)(奧斯伯F.M.等,2005;Josephetal.,1989):以菌株的基因組DNA為模板,利用16SrDNA的通用引物:正向引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(Escherichiacolibases8to27);反向引物5’-TACCTTGTTACGACTT-3’(Escherichiacolibases1507to1492),構(gòu)建20μL的反應(yīng)體系(模板DNA1μL,dNTP(0.2mmol·L-1)2μL,引物(0.5μmol·L-1)各2μL,10×Buffer2μL,超純水12μL,Taq酶(2.5U·μL-1)0.5μL).PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min,進(jìn)入熱循環(huán):94℃變性30s,53℃退火30s,72℃延伸1min,共30個循環(huán).取PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳.采用PCR回收試劑盒回收純化1.5kb左右的目的片段.純化回收的PCR產(chǎn)物委托上海博亞生物公司測序.3)目的菌株系統(tǒng)發(fā)育地位的確定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究挑選數(shù)據(jù)庫中同源性相近的15株細(xì)菌的16SrDNA序列系統(tǒng)用于進(jìn)化發(fā)育學(xué)分析,用MEGAversion3軟件包中的Kimura2-ParameterDistance模型計算進(jìn)化距離,用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,1000次隨機(jī)抽樣,計算自引導(dǎo)值(Bootstrap)以估計系統(tǒng)進(jìn)化樹的置信度.2.3細(xì)菌計數(shù)和理化指標(biāo)總氮測定采用GB11894-89過硫酸鉀氧化紫外分光光度法,氨氮測定采用GB7479-87納氏試劑分光光度法,硝氮采用GB7480-87酚二磺酸紫外分光光度法測定,亞硝氮測定采用GB7493-87N-(1-奈基)-乙二胺分光光度法.細(xì)菌計數(shù)采用稀釋平板計數(shù)法(沈萍等,1998).水中溶解性總有機(jī)碳TOC采用總碳分析儀(TOC-5000A,SHIMADZU)測定.3結(jié)果結(jié)果3.1菌株的形態(tài)和生理生化特性結(jié)合平板上的菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果,并用顯色劑檢測最終得到2株效果最好的兼性好氧反硝化菌株,編號ZW23和ZW27.菌株ZW23和ZW27在平板上培養(yǎng)3d后,形成直徑3～5mm的圓形菌落,菌落表面光滑,隆起,呈淡黃色.菌體形態(tài)見圖1,菌株ZW23和ZW27的單細(xì)胞呈桿狀,大小分別是(0.50～0.60)μm×(1.00～1.50)μm和(0.35～0.60)μm×(0.80～1.20)μm.革蘭氏陰性,無芽孢和莢膜.采用半固體穿刺法對其需氧和運(yùn)動性測定發(fā)現(xiàn),兩株菌株都沿著穿刺線自上而下穿透培養(yǎng)基擴(kuò)散生長,表明兩株菌都是兼性菌.按照文獻(xiàn)(東秀珠等,2001),對菌株ZW23和ZW27進(jìn)行生理生化鑒定,特征見表1.根據(jù)形態(tài)學(xué)和生理生化特征測定結(jié)果,初步鑒定菌株ZW23和ZW27是假單胞菌屬(Pseudomonas).3.2有關(guān)目的植物的生物學(xué)特性3.2.1pcr擴(kuò)增檢測圖2為目的菌株總DNA電泳結(jié)果圖.用菌株ZW23和ZW27的基因組DNA作模板,利用16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到長約1.5kb的目的片段,擴(kuò)增結(jié)果見圖3.3.2.2菌株與假單胞菌屬和門多薩菌的相似性分析選取GenBank數(shù)據(jù)庫中15株同源性相近的細(xì)菌與ZW23和ZW27一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果見圖4和圖5.從進(jìn)化樹上可明顯看出,菌株ZW23和ZW27分別與假單胞菌屬(Pseudomonas)中的類產(chǎn)堿桿菌(pseudoalcaligenes)和門多薩菌(mendocina)相似性最高,同源性達(dá)到99%,所以菌株ZW23是假單胞菌屬類產(chǎn)堿桿菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)的一種,菌株ZW27是假單胞菌屬門多薩菌(Pseudomonasmendocina)的一種.3.3生物活性成分的降解在接種菌株ZW23和ZW27的培養(yǎng)液中氮素形態(tài)和濃度的變化結(jié)果見圖6.由圖6中看出,在沒有接入細(xì)菌的對照反硝化培養(yǎng)液(CK)中總氮含量在48h內(nèi)均沒有變化,表明在培養(yǎng)液中的NO-3沒有發(fā)生化學(xué)反硝化.而在接有細(xì)菌ZW23和ZW27的培養(yǎng)液中,經(jīng)測定,初始的12h內(nèi)菌株呈現(xiàn)指數(shù)生長,在24h時細(xì)菌數(shù)量達(dá)到109個·mL-1.對應(yīng)地,培養(yǎng)液中總氮(TN)顯著下降,在6h內(nèi),培養(yǎng)液中總氮均降低了128.82mg·L-1和78.28mg·L-1,TN削減率分別為45.53%和27.76%.6至12h,培養(yǎng)液中總氮濃度依然持續(xù)下降,接種ZW23和ZW27的培養(yǎng)液中TN含量分別減少187.95mg·L-1和185.43mg·L-1,削減率分別達(dá)66.43%和65.54%.由于TN測定中包含了微生物同化的氮,因此,TN的減少主要源于微生物好氧反硝化作用所致,在本研究中總氮的減少程度即代表了反硝化脫氮的效果.從圖6中還可看出,12h后培養(yǎng)液中NO-3-N濃度降至20mg·L-1,脫氮速率分別達(dá)到約21.72mg·L-1·h-1和22.31mg·L-1·h-1,48h時NO-3-N的利用率分別達(dá)到約98.12%和99.68%.反應(yīng)過程中沒有NO-2-N和NH+4-N的積累,培養(yǎng)液中其余33.58%(ZW23處理)和34.46%(ZW27處理)的TN則主要被轉(zhuǎn)化為微生物氮.由此推測,碳源提供的電子供體,一部分經(jīng)由電子傳遞鏈傳遞給氧,同時釋放能量,利用NO-3-N作為生物合成的氮源,細(xì)胞增殖.而另一部分電子則傳遞給NO-3-N,好氧條件下進(jìn)行反硝化作用,引起體系總氮下降.值得注意的是,在兩株菌進(jìn)行好氧反硝化的同時,它們對培養(yǎng)液中有機(jī)碳源的消耗與利用也十分明顯(見圖6).在12h內(nèi),初始濃度2756mg·L-1的總有機(jī)碳(TOC)分別減少50.66%和52.74%,36h內(nèi),消耗率約90%,減少的有機(jī)碳濃度約2500mgC·L-1.TOC的減少一方面是由于部分有機(jī)物被微生物分解而提供能量,另一方面,部分有機(jī)物被微生物利用合成了新的細(xì)胞物質(zhì)所致.目前,已報道分離出的好氧反硝化菌其脫氮速率大多數(shù)在4.50～13.67mg·L-1·h-1(Patureauetal.,2000;黃運(yùn)紅等,2007;Paietal.,1999;Suetal.,2001;馬放等,2005).而本試驗分離出的兩株菌其脫氮速率是這些菌的1.60～4.89倍.由此可見,菌株ZW23和ZW27對溶液中高濃度的氮和有機(jī)碳的這種影響對水處理工程中氮和COD的去除有十分重要的意義.因為大部分氮可在短時間內(nèi)(12h內(nèi))通過反硝化去除,而剩下的氮和COD還可通過微生物利用加速其增殖后再通過二次沉淀池分離活性污泥而去除.4胞菌的分離和碳源的利用1)分別從淹水水稻土和活性污泥中分離到兼性好氧反硝化細(xì)菌菌株ZW23和ZW27,經(jīng)鑒定兩株細(xì)菌分別是假單胞菌屬類產(chǎn)堿桿菌Pseudomonaspseudoalcaligenes和假單胞菌屬門多