病毒受體的研究進展

病毒受體的研究進展

病毒受體的研究一直是病毒研究的熱點。病毒受體是病毒入侵靶細胞的門戶,能特異性的與病毒結合,介導病毒入侵,是關系到病毒宿主范圍的一個決定性因素。隨著研究手段的進步,近年來有關病毒受體的研究已有較大進展,部分病毒受體的結構和功能已在不同程度上得到確認。絕大多數(shù)受體的本質(zhì)是蛋白,所以研究蛋白相互作用的方法都可用來研究受體。鑒定受體的研究方法總體上從蛋白和基因兩個途徑入手。較早用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法是偶聯(lián)、免疫共沉淀等生物化學方法及病毒蛋白鋪覆技術(Virusoverlayproteinblotassay,VOPBA)等。近年來開始采用一些以DNA重組克隆為基礎的分子生物學方法,如噬菌體展示、酵母雙雜交系統(tǒng)等。每一種方法各有所長,有時需要聯(lián)合應用,相互印證結果的可靠性。WSSV(對蝦白斑綜合癥病毒)是近年來對蝦暴發(fā)性流行病的主要病原,如果我們掌握了其受體的結構、功能,就可以更好的了解病毒的傳染機制、致病機理。預防與治療的思路之一,就是從切斷傳播途徑入手,合成類似受體的、可與病毒結合的阻斷劑、抗體等新型藥物,來控制病害的蔓延與傳播;另外就是根據(jù)其受體基因結合遺傳育種技術篩選、培育抗病個體。目前相關WSSV受體的研究報道還較少,本文旨在通過對可用于病毒受體鑒定的方法進行介紹和總結,為對蝦病毒受體的篩選鑒定提供參考。1病毒與受體的結合病毒鋪覆蛋白印跡技術是較早用與病毒受體鑒定的方法。它是在Western印跡技術的基礎上,利用病毒與受體特異性結合的特點,對病毒受體進行鑒定的方法。它的基本操作步驟是,利用清潔劑裂解細胞膜然后做SDS電泳,轉印于硝酸纖維素膜,與病毒結合,最后洗去未結合病毒。病毒與受體結合的顯示方法有兩種:一是直接利用同位素標記的病毒粒子;二是用單克隆抗體或多抗與病毒結合。使用多抗要避免與寄主蛋白發(fā)生交叉反應,如有交叉反應,可通過寄主蛋白預吸收封閉與多抗結合的寄主蛋白來消除。使用本方法的前提是受體活性是由單一多肽決定而不需要膜的其它組份,而且經(jīng)過裂解液的處理不會喪失活性。如是碳水化合物型受體,就可用薄層層析來分離糖脂,然后檢測與病毒的結合情況。用此方法進行受體研究的病毒有:登革熱病毒、斜紋夜蛾多角體包埋型病毒、牛病毒性腹瀉病毒、犬細小病毒、犬瘟熱病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、偽狂犬病毒、豬流行性腹瀉等。2噬菌體的分子檢測噬菌體展示的基本原理就是將外源基因插入到噬菌體衣殼蛋白基因中使之與衣殼蛋白融合表達,隨著噬菌體的成熟裝配,融合蛋白展示于噬菌體表面并能保持較好的空間構型。到目前為止,利用此方法已陸續(xù)建立了噬菌體隨機肽庫、抗體庫、cDNA展示文庫等技術,并廣泛用于配體-受體關系的研究中。以絲狀噬菌體為例,絲狀噬菌體屬于單鏈DNA病毒,其DNA在細菌內(nèi)滾環(huán)復制,細菌不被裂解,但生長速度減慢,而且可分泌出大量成熟的噬菌體顆粒(每代約100個)。較早發(fā)展的是f1,fd和M系列絲狀噬菌體載體,它們的單鏈DNA長約7000bp,一級結構極為相似(99%同源性)。其編碼的主要衣殼蛋白為pⅧ,其次為pⅢ,pⅥ,pⅦ和pⅣ。展示區(qū)利用的是pⅢ和pⅧ的N端,因為此端是游離的。要表達的序列插入其末端以融合蛋白的形式表達。利用噬菌體篩選目的蛋白基于3個基本事實①插入外源基因并表達在噬菌體顆粒表面,不影響噬菌體的生活周期,同時其外源蛋白天然構象也能被相應的抗體或受體所識別②利用連接于固相支持物(玻璃珠、酶標板等)的靶分子(或統(tǒng)稱篩選劑或受體),可以采用適當?shù)腜anning方法(親和、洗脫、擴增、親和的循環(huán)步驟)洗去非特異結合的噬菌體,最終篩選出能結合靶分子的目的噬菌體(或統(tǒng)稱配體)③外源蛋白或多肽表達在噬菌體表面,其編碼基因與噬菌體DNA是偶聯(lián)的,通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序推導出來,這是其它一些技術做不到的,此技術的優(yōu)勢是可在體外完成對外源多肽或蛋白的研究并方便的獲得目的DNA序列。這類單鏈噬菌體是測序和突變分析的理想材料,不足是培養(yǎng)期長、不穩(wěn)定、表達的肽鏈較短。近年來發(fā)展的λ噬菌體、T7噬菌體等裂解性噬菌體載體生長快,穩(wěn)定性強,可表達較長序列,并且其構象更接近于天然情況,適合用來構建cDNA展示文庫,董倩等利用T7cDNA噬菌體展示方法篩選了乙型肝炎病毒前S1蛋白的結合蛋白。由于原核表達系統(tǒng)沒有對真核基因內(nèi)含子的剪接功能,所以噬菌體展示系統(tǒng)只能表達原核生物基因、不需要內(nèi)含子及外顯子拼接的DNA病毒,或是由真核生物或RNA病毒等的mRNA反轉錄的cDNA。3酵母雙雜交系統(tǒng)論yeastwell隨著分子生物學技術的發(fā)展,近年來開發(fā)了一些研究蛋白之間相互作用的更簡便有效的方法。其中之一是由Fields和Song創(chuàng)立的酵母雙雜交系統(tǒng)(YeastTwo-HybridSystems),與傳統(tǒng)方法相比,它最突出的特點是可以在酵母這種生長迅速且易操作的體系內(nèi)部研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,避開了傳統(tǒng)的體外方法中實驗條件對蛋白質(zhì)研究的不利影響,且無需體外純化蛋白、一次操作可分析大量基因編碼區(qū),靈敏度高,而且通過篩選基因組文庫或cDNA文庫可以直接找到與誘餌蛋白相互作用蛋白的DNA序列。3.1轉錄激活蛋白的激活和恢復雙雜交系統(tǒng)的產(chǎn)生基于對酵母轉錄因子Gal4蛋白的認識。天然Gal4分子是Gal1基因轉錄必需的蛋白質(zhì)因子,它由一條多肽鏈組成,含881個氨基酸。它有兩個相對獨立的結構域:DNA結合域(DNA-BindingDomain,DNA-BD),由位于N-末端的147個氨基酸組成,功能是識別并結合位于Gal1基因的上游激活序列(UpstreamActivatingSequence,UAS);另一個是轉錄激活域(ActivatingDomain,AD),由位于C-末端的768~881個氨基酸構成,負責RNA聚合酶復合體激活轉錄的功能。DNA-BD和AD對激活轉錄是必不可少的,二者之一單獨作用不能激活轉錄反應。研究表明,當這兩個功能域位于不同肽鏈上,只要它們在空間上充分接近,即使是非共價結合也能夠恢復Gal4作為轉錄因子的活性?；谏鲜鍪聦?可以借助兩個能相互作用的蛋白質(zhì)為紐帶,將相互分開的DNA-BD和AD在空間上拉近,構建一個融合的、具有功能的轉錄激活蛋白。一般是將已知蛋白(常稱為誘餌蛋白,baitprotein或X蛋白)的基因與編碼DNA-BD的序列融合并在酵母中共表達產(chǎn)生融合蛋白Gal4-BD-Bait,同時將編碼未知蛋白(常稱為prey或Y蛋白)的基因與編碼AD的序列融合并在酵母中共表達產(chǎn)生另一融合蛋白Gal4-AD-prey,將以上兩個酵母株融合,如果兩個外源蛋白有結合活性,那么借助Bait和prey的連接使得Gal4-BD和Gal4-AD空間上靠近,恢復其轉錄激活蛋白的活性,并激活報告基因。也可以將兩個分別構建的質(zhì)粒載體共轉化一個酵母株。目前有很多生物公司以試劑盒的形式提供酵母雙雜交系統(tǒng)。本系統(tǒng)的核心組成就是兩種分別用于構建bait和prey融合蛋白的質(zhì)粒及相應宿主酵母株。宿主酵母已經(jīng)過改造,除去了Gal4基因活性,并重組入新的報告基因。報告基因有顯色型的如LacZ、MEL,營養(yǎng)選擇標記基因一般為Leu、His、Ade等,為了增加陽性克隆的可信度,一般同時構建幾個報告基因,不同報告基因之間是并聯(lián)關系,互不影響,可聯(lián)用,也可選用。不同的報告基因對轉錄激活蛋白的敏感度是不同的,而且有些報告基因有基底水平的表達,遇到這種情況可用一些表達產(chǎn)物的抑制劑減少背景。還有一種情況是,有些bait蛋白本身就有轉錄因子活性,這時就需要對其DNA序列進行改造,酸性的兩親性結構域傾向于有轉錄活性,不過改造也有可能除去誘餌蛋白的結合功能,需慎重。近年來,酵母雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)相互作用的研究中得到廣泛應用,李凌云等利用本系統(tǒng)篩選出了麻疹病毒的絨猴細胞受體基因。本實驗室正在用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選WSSV受體基因,我們以較易為WSSV感染的中國對蝦鰓組織為材料提取總RNA構建一個cDNA文庫,以WSSV的粘附蛋白(vriusattchmentprotion)VP39為誘餌構建融合質(zhì)粒,將含誘餌質(zhì)粒的菌株與cDNA文庫融合并利用選擇性培養(yǎng)基篩選,最后分析陽性克隆。3.2母乳喂養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展3.3.1雜交系統(tǒng)在研究細胞信號傳遞的過程中常涉及到第三個分子的作用,于是發(fā)展了三雜交系統(tǒng)。它的原理是,除利用了傳統(tǒng)的雙雜交系統(tǒng)中的兩個融合蛋白AD-prey和BD-bait外,還必須借助第三個分子的參與實現(xiàn)相互作用,第三個分子可以是蛋白質(zhì)、多肽、小分子配體、RNA等。3.3.2單混合系統(tǒng)單雜交系統(tǒng)用于檢測蛋白與DNA序列的相互作用,不再贅述。3.3.3雙向雙雜交和反向單雜交負選擇系統(tǒng)也叫反向選擇系統(tǒng),與正向選擇系統(tǒng)的區(qū)別在于其報告基因的誘導機制或表達結果不同:一種是當報告基因被BD-X/AD-Y激活時,表達產(chǎn)物直接或間接對宿主細胞有毒;另一種方式是在正向報告基因上游再引入一個含阻遏子的操縱元,當BD-X/AD-Y有相互作用時則激活阻遏蛋白的轉錄,阻遏蛋白就會抑制報告基因的表達。反向雙雜交系統(tǒng)用于篩選蛋白突變體和確定能夠打破特異蛋白相互作用的試劑。反向單雜交系統(tǒng)用于分析DNA結合蛋白的突變或特異DNA序列突變對二者相互作用的影響。反向三雜交系統(tǒng)可用來研究兩個已知蛋白相互作用的解離劑。3.3.4酵母雙雜交的基因表達傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)是由RNA聚合酶Ⅱ來轉錄報告基因,而建立在RNA聚合酶Ⅱ激活轉錄基礎上的酵母雙雜交系統(tǒng)的不足是不能研究與激活因子或輔助激活因子的相互作用蛋白,因它本身就可激活報告基因的表達,這也可能是酵母雙雜交系統(tǒng)存在假陽性的原因之一。RNA聚合酶Ⅲ主要用來轉錄tRNA。在酵母菌株中通過改造,用RNA聚合酶Ⅲ替換RNA聚合酶Ⅱ,就可避免由于bait蛋白具有激活RNA聚合酶Ⅱ而導致報告基因表達的情況。3.3.5微生物及其產(chǎn)物酵母雙雜交系統(tǒng)的缺陷是不能研究高等生物中常見的需翻譯后加工的蛋白質(zhì)之間的相互作用,如磷酸化、甲基化、糖基化、二硫化等。VidalM建立的哺乳動物雙雜交系統(tǒng)用氯霉素乙酰轉移酶為報告基因。其活性可在細胞提取物中檢測。該方法主要用于檢驗已知蛋白的相互作用。3.3.6酵母膜的信質(zhì)元素以上介紹的幾種酵母雙雜交系統(tǒng),其蛋白的相互作用是發(fā)生在核內(nèi)的,但有些全長的跨膜蛋白要么不能有效的轉運到細胞核中,或轉運進去后,由于不能正確折疊或穩(wěn)定性差,使蛋白相互作用很弱或不能發(fā)生。因此對于研究膜蛋白含膜受體、分泌蛋白及胞質(zhì)蛋白等就有很大局限性。AronheimA等建立了應用SOS招募系統(tǒng)(SOSRecruitmentsystem,SRS)。在SOS招募系統(tǒng)中,蛋白質(zhì)的相互作用被人為限制在酵母細胞膜上,該系統(tǒng)利用真核生物中普遍存在的ras信號傳導途徑作為蛋白質(zhì)相互作用的選擇標記。Ras是一個膜偶聯(lián)信號蛋白。在本系統(tǒng)中,利用酵母的溫度敏感株、在36°C不能生長的Ras途徑突變體作為宿主,將人的SOS蛋白與Bait蛋白融合,Prey蛋白通過與豆蔻酰化信號蛋白融合定位于膜上。若Bait與Prey能結合,則SOS蛋白就會被招募在細胞膜上并激活Ras蛋白,產(chǎn)生Ras途徑,使突變株在36℃可以生長。4蛋白質(zhì)功能及相互作用蛋白質(zhì)芯片是在后基因組時代為闡明基因組計劃中測定的許多不明功能序列的基因的作用而發(fā)展的新技術,與研究蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)生化技術相比,其優(yōu)點是高通量,微型化。蛋白質(zhì)芯片可以點陣排列的方式在很小的片基上有序的集成多種蛋白質(zhì)活性分子(配基),利用微量生理或生物采樣,可以同時檢測和研究不同蛋白質(zhì)的功能及蛋白質(zhì)之間的相互作用。蛋白質(zhì)芯片是一種用于蛋白質(zhì)組水平研究的理想方法。目前已開發(fā)的蛋白質(zhì)芯片技術,一種是建立在橢偏成像原理基礎上的光學生物分子分析技術,通過在芯片表面上由蛋白之間的相互作用引起的蛋白薄層厚度的變化,利用橢偏分析與快速電子攝像技術顯示蛋白分子之間的相互作用,具高空間分辨率、快速取樣和操作簡單的特點。由此又衍生了活性探針及光學多元蛋白芯片技術。另一種是用載玻片制作的熒光標記蛋白質(zhì)芯片,此芯片的技術的優(yōu)點是易于實現(xiàn),用標準的實驗室設備就能做到。同DNA分子相比,蛋白質(zhì)分子的空間結構復雜,其生物活性與空間結構密切相關;蛋白質(zhì)不能被簡單的擴增或原位合成,難以利用拷貝增加的方式來提高檢測的靈敏度;其次,蛋白質(zhì)的相互作用無序列可循,而是類似于抗原-抗體的特異結合作用;另外,在操作過程中,蛋白質(zhì)很容易變性。因此,蛋白質(zhì)芯片技術在具有巨大的發(fā)展?jié)摿Φ耐瑫r,它的開發(fā)難度也是很大的。5yfp和cfp的相互作用熒光共振能量轉移技術利用了綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)及其突變體做為融合標記物來指示蛋白之間的相互作用,當兩個熒光發(fā)色基團在足夠靠近時,供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài),在該電子回到基態(tài)前,通過偶極子相互作用,實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉移(即發(fā)生能量共振轉移)。以GFP的兩個突變體藍綠色熒光蛋白(cyanfluorescentprotein,CFP)、黃色熒光蛋白(yellowfluorescentprotein,YFP)為例簡要說明其原理:CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜有相當?shù)闹丿B,當它們足夠接近時,用CFP的吸收波長激發(fā),CFP的發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉移至YFP的發(fā)色基團上,所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失,主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個發(fā)色基團之間的能量轉換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比,對空間位置的改變非常靈敏。例如要研究兩種蛋白質(zhì)a和b間的相互