基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的蠟梅花遺傳毒性研究

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的蠟梅花遺傳毒性研究

蠟梅是蠟梅科的一種落葉灌木，專門(mén)種植于中國(guó)。這花在寒冷的冬天盛開(kāi)，充滿花香。它是中國(guó)傳統(tǒng)的花之一。蠟梅具有悠久的栽培歷史,本草綱目中寫(xiě)到“蠟梅,釋其名為黃梅花,此物非梅類,因其與梅同時(shí),香又相近,色似蜜蠟,故此得名?！毕灻酚裂?適應(yīng)性強(qiáng),栽培分布廣泛,在極端最低溫度-25℃的條件下,仍能正常生長(zhǎng)開(kāi)花。蠟梅花香芬馥,清雅宜人,有一花香十里的美名,且花瓣晶瑩,清麗淡雅,又在嚴(yán)冬開(kāi)放,因此具有良好的觀賞價(jià)值,是園林中不可多得的綠化樹(shù)種。目前對(duì)蠟梅的研究多基于資源分布、形態(tài)分析、分子標(biāo)記、化學(xué)成分分析、切花保鮮等,蠟梅分子生物學(xué)研究進(jìn)展緩慢,對(duì)于整個(gè)蠟梅花基因表達(dá)規(guī)律的研究不多,其基因數(shù)據(jù)庫(kù)資源也極少。近年來(lái),包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組的各種組學(xué)技術(shù)在揭示細(xì)胞生理活動(dòng)規(guī)律和生物代謝機(jī)理的研究中起著越來(lái)越重要的作用。轉(zhuǎn)錄組是指特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的總和,包括mRNA和非編碼RNA。通過(guò)對(duì)同一物種不同樣品間進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,在能夠得到大量的功能基因的基礎(chǔ)上,還可獲得樣品間的表達(dá)差異,這對(duì)于揭示基因表達(dá)與植物表型的關(guān)系具有重要的意義。在植物中,最新RNA測(cè)序技術(shù)已逐步取代基因芯片技術(shù)成為目前從全基因組水平研究基因表達(dá)的主流方法。為此我們采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),對(duì)蠟梅花發(fā)育不同時(shí)期、不同部位進(jìn)行高通量測(cè)序,對(duì)序列進(jìn)行組裝拼接,建立起蠟梅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。1干預(yù)數(shù)據(jù)庫(kù)的組成和分析1.1soapdeovo法基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的優(yōu)勢(shì),以紅心蠟梅H29為材料,選取蕾期花芽和盛開(kāi)期花朵為樣本,構(gòu)建了第1個(gè)蠟梅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。采用Illumina測(cè)序平臺(tái),建好的測(cè)序文庫(kù)用IlluminaGAIIx進(jìn)行測(cè)序,總共獲得3.8Gb數(shù)據(jù),經(jīng)過(guò)去除雜質(zhì)和冗余處理,獲得250萬(wàn)個(gè)75bp的序列。將序列剪切成21個(gè)堿基片段之后采用SOAPdenovo軟件進(jìn)行拼接,得到229065個(gè)contig,平均長(zhǎng)度為240bp,大于200bp的contig占36.52%。采用雙末端測(cè)序法能夠確定來(lái)自同一轉(zhuǎn)錄本的不同contig,利用SOAPdenovo將這些contig連在一起,通過(guò)序列聚類軟件TGICL做進(jìn)一步序列拼接和去冗余處理,得到盡可能長(zhǎng)的非冗余Unigene(獲得100685個(gè)),平均長(zhǎng)度為513bp,大于500bp的Unigene有29432條,占總數(shù)的29.22%,有接近60%的Unigene不含Gap(堿基不能確定的位點(diǎn))。1.2unigere的分類統(tǒng)計(jì)將Unigene組裝完成后,為了對(duì)Unigene進(jìn)行功能注釋,將Unigene序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)nr、Swiss-Prot、KEGG和COG,得到與給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白,從而獲得Unigene的蛋白功能注釋信息。COG數(shù)據(jù)庫(kù)是對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫(kù),每個(gè)COG蛋白都被假定來(lái)自祖先蛋白,COG數(shù)據(jù)庫(kù)是基于細(xì)菌、藻類、真核生物具有完整基因組的編碼蛋白、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行構(gòu)建的。我們將Unigene和COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),預(yù)測(cè)Unigene可能的功能并對(duì)其做功能分類統(tǒng)計(jì)。蠟梅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中有14922個(gè)Unigene分布于24個(gè)COG分類中,其中聚類到一般功能預(yù)測(cè)的Unigene最多,其次有聚類于轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組功能分類和修復(fù)功能分類。Geneontology(簡(jiǎn)稱GO)是一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系,可以全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息,使用Blast2GO軟件得到Unigene的GO注釋信息,之后用WEGO軟件對(duì)所有Unigene做GO功能分類統(tǒng)計(jì),從宏觀上認(rèn)識(shí)蠟梅花的基因功能分布特征。在總共54個(gè)GO聚類中,蠟梅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的Unigene可以歸納到43個(gè)GO聚類中,其中有大量的基因聚類到了代謝過(guò)程、催化反應(yīng)、結(jié)合過(guò)程、細(xì)胞進(jìn)程功能區(qū)。KEGG是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑以及基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫(kù),利用KEGG可以進(jìn)一步研究基因在生物學(xué)上的復(fù)雜行為,準(zhǔn)確預(yù)測(cè)基因的功能。蠟梅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中共有31142個(gè)Unigene注釋到5個(gè)大的代謝途徑(其中有超過(guò)半數(shù)的Unigene歸類于新陳代謝途徑和遺傳信息傳導(dǎo)途徑),266個(gè)不同的代謝途徑分支中。在新陳代謝途徑中有超過(guò)60%的Unigene注釋到碳水化合物代謝、脂類物質(zhì)代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、酶家族和能量代謝的代謝途徑分支中。在遺傳信息傳導(dǎo)代謝途徑中,Unigene主要?dú)w類于細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡、免疫系統(tǒng)代謝分支中。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)全面的包含了蠟梅花中表達(dá)的基因,并對(duì)基因進(jìn)行了功能預(yù)測(cè),這為今后更深入研究蠟梅功能基因組,遺傳機(jī)制,開(kāi)花機(jī)理,花香、花色、抗寒的基因克隆提供了極大的方便,而且該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)還可以作為今后蠟梅基因組注釋的參考序列,為蠟梅的分子生物學(xué)研究提供寶貴的基因組數(shù)據(jù)來(lái)源。2根據(jù)轉(zhuǎn)換組的數(shù)據(jù)，蠟蜜的二次代謝產(chǎn)物合成2.1蠟梅花香成分檢測(cè)蠟梅花香沁人,香味清雅,香飄十里,花香是蠟梅重要的觀賞特性,也是生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟(jì)性狀。目前關(guān)于花香成分的鑒定已經(jīng)趨于成熟,大約有700多種花香物質(zhì)從60個(gè)科的植物中被鑒定?；ㄏ愠煞种饕?大類物質(zhì),即萜烯類化合物、苯丙酸類化合物/苯環(huán)型化合物和脂肪酸衍生物。對(duì)于蠟梅花香物質(zhì)的研究已有一些進(jìn)展,Deng等首次利用動(dòng)態(tài)頂空固相萃取法提取蠟梅鮮花花香物質(zhì),利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析出花香主要物質(zhì)是水楊酸甲酯、芳樟醇和苯甲醇。Azuma等使用相似方法提取的香味成分中乙酸芐酯為主要物質(zhì)(42.2%),反式-β-羅勒烯(24.8%),芳樟醇(17.2%)和苯甲醇(6.9%)。周明芹等采用頂空固相微萃取技術(shù)檢測(cè)6個(gè)蠟梅基因型鮮花花香成分,認(rèn)為萜烯類物質(zhì)是花香的主要成分。而Farsam等使用水蒸餾法萃取蠟梅花揮發(fā)性物質(zhì),認(rèn)為花香主要成分是欖香醇等,這和使用動(dòng)態(tài)頂空法測(cè)定的花香成分有很大不同,在其測(cè)定的32種花香成分中只有4種相一致。使用動(dòng)態(tài)頂空法測(cè)定的花香成分中,芳樟醇含量較多,而采用水蒸餾法提取物中芳樟醇含量很少。Li等測(cè)定了蠟梅花發(fā)育不同時(shí)期香味成分,認(rèn)為芳樟醇和水楊酸甲酯的含量在花芽期最大,隨著花的開(kāi)放而減少,乙酸芐酯的含量則是在開(kāi)花末期含量最高。通過(guò)以上研究認(rèn)為在蠟梅花香成分中萜烯類物質(zhì)占主導(dǎo)作用,但是不同品種和提取工藝對(duì)花香成分測(cè)定有很大的影響。目前已經(jīng)克隆出來(lái)的花香基因法呢基焦磷酸合成酶在類異戊類二烯代謝途徑中起著關(guān)鍵作用,主要功能催化法呢基焦磷酸的合成。在蠟梅花的整個(gè)開(kāi)放過(guò)程中,CpFpps基因的表達(dá)量表現(xiàn)為隨著花的開(kāi)放逐漸增大,然后在花授粉后急劇下降。CpFpps基因在蠟梅整個(gè)植株都有表達(dá),在葉片中表達(dá)量最高,花被片次之。萜烯類化合物屬于次生代謝產(chǎn)物,轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到次生代謝產(chǎn)物代謝途徑的Unigene基因有1117個(gè),代謝途徑有21個(gè)不同的分支,其中與萜烯類物質(zhì)合成相關(guān)的代謝途徑有4個(gè)(286個(gè)Unigene)。其中Unigene富集豐度最高的為檸檬烯派烯降解途徑,其次是萜類合成機(jī)制。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),286個(gè)Unigene在KEGG途徑上位于48個(gè)萜烯類物質(zhì)合成的調(diào)控位點(diǎn)上。CpFpps基因就類屬于萜類主鏈生物合成代謝途徑。值得注意的是在4條與萜烯類物質(zhì)合成相關(guān)的代謝途徑中,有超過(guò)一半的Unigene是參與檸檬烯派烯降解途徑的。蠟梅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)大量的基因進(jìn)行了功能預(yù)測(cè),并將其錨定在特定的代謝途徑中,這對(duì)于發(fā)掘合成蠟梅花香物質(zhì)的關(guān)鍵催化酶基因提供了可靠的依據(jù),有助于今后全面的掌握花香物質(zhì)代謝的特點(diǎn)并為深入的研究蠟梅花香物質(zhì)合成提供了新的思路。2.2類黃酮類物質(zhì)代謝產(chǎn)物的代謝途徑和同源度分析蠟梅花色如凝蠟,花香怡人,又在隆冬開(kāi)放,在切花市場(chǎng)上有很大的發(fā)展前景,但其花色品種較為單一,色彩也不夠艷麗,培育其他顏色的品種一直是生產(chǎn)者和研究者的目標(biāo),但收效甚微。目前對(duì)蠟梅花色素的組成已有初步的鑒定分析,認(rèn)為主要是類黃酮類物質(zhì)。在植物次生代謝產(chǎn)物的研究中,對(duì)類黃酮類物質(zhì)代謝途徑研究較為清楚。類黃酮類物質(zhì)代謝途徑,是苯丙烷類代謝途徑的一個(gè)重要分支,其主要功能是與植物色素合成相關(guān)。蠟梅花瓣的中被片主要含類黃酮,紅色的內(nèi)瓣色素為花青苷和類黃酮的混合物。類黃酮類物質(zhì)屬于次生代謝產(chǎn)物,其代謝途徑主要涉及3條代謝通路:花青素生物合成途徑、類黃酮生物合成途徑、黃酮和黃酮醇生物合成途徑。蠟梅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為我們提供大量參與調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的數(shù)據(jù)。通過(guò)與其他4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),共獲得了105個(gè)與花色代謝合成相關(guān)的Unigene。其中,有11個(gè)Unigene注釋到花青素生物合成途徑,70個(gè)注釋到類黃酮生物合成途徑、24個(gè)注釋到黃酮和黃酮醇生物合成途徑。對(duì)105個(gè)與花色合成相關(guān)的Unigene進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),其平均長(zhǎng)度677bp,46個(gè)片段介于200~500bp,24個(gè)片段介于500~1000bp,21個(gè)片段大于1000bp。將Unigene與nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)Unigene的同源度都較高(E值<10-5),其中有45條片段與nr數(shù)據(jù)相比具有極高的同源度(E值<10-50),這對(duì)于Unigene的功能鑒定和基因克隆提供了很大的方便。在3條類黃酮類物質(zhì)代謝途徑中,有14條片段既注釋到了類黃酮生物合成途徑又在黃酮和黃酮醇生物合成途徑之中,說(shuō)明這些基因可能是關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)基因。對(duì)于參與花色素合成的代謝途徑的分析,為今后克隆花色合成基因提供了有效的依據(jù),可望從分子水平上找到影響中、內(nèi)被片花色積累的關(guān)鍵功能基因,從而為蠟梅花色改良奠定基礎(chǔ)。2.3分離和鑒定原則蠟梅傲雪開(kāi)放,花香怡人,是良好的園林美化、綠化樹(shù)種,同樣也是營(yíng)造具有中國(guó)特色的園林景觀不可缺少的灌木。除了觀賞價(jià)值外,蠟梅花也有重要的藥理價(jià)值。蠟梅屬植物含有豐富的生物堿,有抗菌、降壓、增強(qiáng)免疫的作用。目前已從蠟梅種子中分離出若干不同類型的生物堿,并對(duì)其做了初步的研究,但鮮有從花中分離鑒定生物堿的報(bào)導(dǎo)。例如Zhang等從蠟梅種子中分離出蠟梅堿和葉坎生2種生物堿,在體外進(jìn)行抗病原菌試驗(yàn),證明這2種生物堿對(duì)5種不同的病原菌都具有良好的抗性。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的優(yōu)勢(shì),我們發(fā)現(xiàn)在次生代謝產(chǎn)物途徑中,3條與生物堿合成相關(guān)的代謝途徑中共有123個(gè)Unigene參與生物堿合成,這從側(cè)面反映蠟梅花中同樣含有多種不同種類的生物堿,有助于拓寬蠟梅花的應(yīng)用領(lǐng)域。3基于轉(zhuǎn)錄本的基因分