細(xì)胞工程學(xué)：第13章 體外受精與核移植動(dòng)物

第13章體外受精與核移植動(dòng)物本節(jié)主要內(nèi)容13-1體外受精動(dòng)物（試管動(dòng)物、試管嬰兒）13-2核移植動(dòng)物（克隆動(dòng)物）13-1體外受精動(dòng)物一定義體外受精(Invitrofertilization，IVF)是指將哺乳動(dòng)物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過(guò)程的技術(shù)。體外受精動(dòng)物也稱試管動(dòng)物（test-tubeanimal），是指將供體的精子和卵子在體外受精，體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育到一定階段通過(guò)胚胎移植移入受體完成發(fā)育出生的動(dòng)物。例如：“世界山羊之王”波爾山羊體格高大，四肢粗壯，身體豐滿。平均日增重350克，屠宰出肉率可達(dá)60%以上。具有適應(yīng)性強(qiáng)、采食性廣、繁殖性能好、肉用性十分顯著等特點(diǎn)。

二優(yōu)點(diǎn)（1）發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力：一頭優(yōu)良品種母牛的卵巢內(nèi)有幾萬(wàn)個(gè)生殖細(xì)胞，但在一個(gè)正常性周期內(nèi)只有幾個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育，最后一個(gè)卵泡成熟并排卵。一只良種母畜一生大約只能繁殖10個(gè)左右的后代，大部分時(shí)間用于妊娠和哺乳。試管動(dòng)物繁殖技術(shù)能夠充分利用母體生殖潛力。（2）促進(jìn)家畜改良的速度：繁殖能力的提高促進(jìn)家畜改良速度，加速育種過(guò)程。（3）保存遺傳資源：對(duì)優(yōu)良或稀有哺乳動(dòng)物建立“胚胎庫(kù)”，進(jìn)行受精卵或胚胎的長(zhǎng)期保存。三試管動(dòng)物培育流程（1）精子采集與體外獲能、卵子采集與成熟培養(yǎng)（2）體外受精（3）重組胚激活與體外培養(yǎng)（4）胚胎移植(Embryotransfer，ET)：是指將受精卵或發(fā)育到一定階段的胚胎移植到與供體同時(shí)發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的“受體”母畜輸卵管或子宮的技術(shù)（5）體內(nèi)發(fā)育、出生1精子采集與體外獲能采集：精子上游法采集，在精液上面加入少量培養(yǎng)液，有活力的精子游到表面，收集。精子獲能(Capacitation)是指精子獲得穿透卵子透明帶能力的過(guò)程。精子的頂體反應(yīng)：遇到卵子時(shí)，精子頭部“頂體”脫落，頂體酶釋放，使卵子的放射冠和透明帶溶解，精子進(jìn)入卵細(xì)胞，達(dá)到受精的目的。體內(nèi)獲能雄性精液中含有“去能因子”（多是：糖蛋白），附在精子表面，是頂體酶的抑制劑，抑制了精子的受精能力。去能因子的清除，使精子頂體酶活性恢復(fù)，具有受精能力：主要依靠宮頸、子宮及輸卵管液中的β淀粉酶、胰蛋白酶、β葡糖苷酶及唾液酸酶，后者在卵泡液中含量也很高，可以水解糖蛋白等“去能因子”。體外獲能精子由最初在同種或異種雌性生殖道孵育獲能，發(fā)展到用子宮液、卵泡液、子宮內(nèi)膜提取液或血清等在體外培養(yǎng)獲能，最后用化學(xué)成分明確的溶液培養(yǎng)獲能。牛、羊的精子常用化學(xué)藥物誘導(dǎo)獲能，誘導(dǎo)獲能的藥物常用肝素和鈣離子載體。1986年P(guān)arrish等用含肝素的介質(zhì)處理牛的冷凍精液，然后與體外成熟的卵母細(xì)胞體外受精獲得成功。2卵子的回收與成熟培養(yǎng)(1)超數(shù)排卵：雌性動(dòng)物用孕酮、促卵泡激素和促黃體素處理后，從輸卵管中沖取成熟卵子，可直接與獲能精子受精。(2)從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞：借助超聲波探測(cè)儀、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡直接從活體動(dòng)物的卵巢中吸取卵母細(xì)胞。成熟卵子的收集卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)未成熟卵母細(xì)胞（初級(jí)卵母細(xì)胞、次級(jí)卵母細(xì)胞要經(jīng)過(guò)成熟培養(yǎng)使卵細(xì)胞成熟。家畜卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液普遍采用TCM199培養(yǎng)基添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。血清是大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來(lái)源，而且可提供細(xì)胞生長(zhǎng)因子。作為能量來(lái)源的物質(zhì)主要是葡萄糖，氨基酸也可作為能源起作用。卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)還需對(duì)溫度、滲透壓、pH、氣相等進(jìn)行控制。卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)：通常采用微滴培養(yǎng)法，微滴體積一般為50-200微升，每個(gè)微滴中一般放入10-40個(gè)卵母細(xì)胞。二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，條件為39℃、100%濕度、5%二氧化碳。成熟選擇標(biāo)志：極體排出、透明帶軟化、卵丘細(xì)胞層擴(kuò)散靠近卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞呈放射狀排列，出現(xiàn)放射冠，用DNA特意性染料染色后，在顯微鏡下進(jìn)行核相觀察，可見卵母細(xì)胞處于第2次成熟分裂中期。3試管動(dòng)物的體外受精精子發(fā)生頂體反應(yīng)時(shí)，精子頂體外膜與其相貼的卵細(xì)胞膜發(fā)生多點(diǎn)融合而破裂，繼而出現(xiàn)小孔。頂體酶就是通過(guò)這些小孔釋放出去，使卵細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞分散并去除放射冠，分解透明帶。精子頂體內(nèi)膜與卵細(xì)胞膜相互融合，最終雄性原核和雌性原核合二為一，完成受精過(guò)程。一般將成熟的卵母細(xì)胞和獲能的精子在一個(gè)合適的體外環(huán)境條件下共同培養(yǎng)一段時(shí)間，就能完成體外受精。受精過(guò)程所采用的培養(yǎng)液與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液類似，但需添加一些特殊物質(zhì)，如腎上腺素、亞牛黃酸、肝素等，它們有助于精子穿卵和促使原核的形成。精子和卵子常在小滴中共培養(yǎng)，受精時(shí)精子密度為1-9×106/ml，每10微升精液中放人1-2枚卵子，小滴體積一般為50-200微升。受精成功觀察：將含有受精卵的培養(yǎng)皿放置于倒置顯微鏡下，卵細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)雌雄原核，標(biāo)志著受精成功。（1）共同培養(yǎng)法（2）顯微受精技術(shù)是通過(guò)人為方法使精子和卵子完成受精過(guò)程，由于一般都需要借助顯微操作儀來(lái)完成，所以又稱顯微授精為輔助受精技術(shù)

(microinsemination)。透明帶下注射法術(shù)：用微注射器將3-5個(gè)精子直接注射入透明帶下的卵間隙，從而使卵子受精。優(yōu)點(diǎn)是對(duì)卵細(xì)胞的損傷小，已在臨床醫(yī)學(xué)上得到運(yùn)用，但也存在多精受精問(wèn)題。卵槳內(nèi)精子注射法：用微注射器將單個(gè)精子直接注射入到卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)使卵子受精。這樣可以避免多精受精問(wèn)題。但是精子質(zhì)量是重要問(wèn)題。精、卵結(jié)合后，透明帶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，阻止了其它精子穿越透明帶，保證了正常的單精受精。透明帶修飾法：運(yùn)用物理或化學(xué)方法對(duì)卵母細(xì)胞的透明帶進(jìn)行打孔、部分切除或撕開缺口，為精子進(jìn)入卵黃周隙打開通道，然后把卵子與一定濃度的精子共培養(yǎng)以完成受精過(guò)程。這種方法適用于具有一定運(yùn)動(dòng)能力，但頂體反應(yīng)不全，無(wú)法穿過(guò)透明帶的精子。優(yōu)點(diǎn)是對(duì)卵子的損傷小，但對(duì)于靠透明帶反應(yīng)阻止多精入卵的動(dòng)物易造成多精子受精，影響胚胎繼續(xù)發(fā)育。4胚胎培養(yǎng)受精卵需在體外培養(yǎng)發(fā)育至桑椹期或囊胚期（細(xì)胞全能性最高）才能進(jìn)行移植。目前人們還不能在體外模擬子宮內(nèi)的環(huán)境供胚胎繼續(xù)發(fā)育。通常情況，移植的較佳時(shí)期是發(fā)育至8-16細(xì)胞期的胚胎。培養(yǎng)液中成分除無(wú)機(jī)和有機(jī)鹽外，還添加維生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等營(yíng)養(yǎng)成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。桑椹胚發(fā)育阻滯問(wèn)題

體外受精的早期胚胎在體外發(fā)育中，往往會(huì)停止在某一階段不再發(fā)育，這種現(xiàn)象稱為發(fā)育阻滯(Developmentalblock)。發(fā)育阻滯是胚胎體外培養(yǎng)的一個(gè)主要障礙。造成胚胎發(fā)育阻滯的因素比較復(fù)雜，與胚胎的母源基因調(diào)控向自身基因調(diào)控的轉(zhuǎn)換有關(guān)，也有培養(yǎng)環(huán)境的客觀因素?？傊?，體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)發(fā)育條件的差異，造成了胚胎發(fā)育被阻斷?？朔椒ǎ焊倪M(jìn)培養(yǎng)液成分和建立體細(xì)胞共同培養(yǎng)體系5胚胎移植將胚胎移植到另外一頭與供體同時(shí)發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的母畜（稱為“受體”）的相應(yīng)部位（輸卵管或子宮角）。這個(gè)來(lái)自供體的胚胎能夠在受體的子宮著床，并繼續(xù)生長(zhǎng)和發(fā)育，最后產(chǎn)下供體的后代。這就是通常所說(shuō)的“借腹懷胎”。手術(shù)法:將同期化處理后的受體動(dòng)物仰面固定在手術(shù)床上，全身麻醉，腹部切口，將一側(cè)卵巢上有黃體發(fā)育的子宮遠(yuǎn)端拉出，將吸有胚胎的胚胎移植管（圖13-1）插入穿刺孔，小心將胚胎輸入。這種方法移卵容易、損傷小、成功率較高。羊等小家畜非手術(shù)法:使用類似于人工授精的專用輸胚槍，將其直接插入排卵側(cè)子宮角內(nèi)，注入胚胎。牛馬大家畜非手術(shù)法手術(shù)法（6）體內(nèi)發(fā)育、出生胚胎移植后處理與觀察：胚胎移植后需補(bǔ)充黃體酮，目前多采用注射法給予黃體酮。胚胎移植后14天，可由驗(yàn)?zāi)蚧虺檠_定是否妊娠。如果確定妊娠，則改用hCG人絨毛膜促性腺激素繼續(xù)補(bǔ)充到懷孕10周。妊娠后14天，B超檢查胎兒數(shù)及胚胎著床部位。免疫膠體金法13-3試管嬰兒試管嬰兒（Test-tubebabyy）是指將卵子與精子取出在體外受精，培養(yǎng)發(fā)育成早期胚胎，再植回母體子宮內(nèi)發(fā)育出生的嬰兒,也就是采用體外受精聯(lián)合胚胎移植技術(shù)培育的嬰兒。試管嬰兒的培育流程良好男性供體人工取精女性供體的超排卵人工受精

受精卵采集 胚胎體外培養(yǎng)女性受體選擇與胚胎移植 體內(nèi)發(fā)育與后代降生萊斯莉·布朗和約翰·布朗是英國(guó)一對(duì)不孕夫婦。1977年夫婦向試管受精技術(shù)先驅(qū)羅伯特·愛(ài)德華博士及帕特里克·斯特普托博士求助。1978年7月25日，世界首例試管嬰兒路易斯·布朗在英國(guó)誕生。成為當(dāng)年全球媒體競(jìng)相報(bào)道的頭條新聞6年后，布朗夫婦二度借助試管受精技術(shù)，再添一女。現(xiàn)在LouisBrown路易斯在郵政部門工作，2004年9月4日，路易斯與時(shí)年34歲的安保部門官員韋斯利·姆林德喜結(jié)連理。1988年3月10日我國(guó)第一個(gè)試管嬰兒誕生

來(lái)自全國(guó)各地的試管嬰兒歡聚一 堂，為鄭萌珠慶賀生日1987年5月，甘肅禮縣鹽關(guān)鎮(zhèn)的鄭桂珍老師來(lái)到北京城，希望做母親的

愿望得以實(shí)現(xiàn)。

截止2006年世 界誕生300萬(wàn)試 管嬰兒。著名的產(chǎn)科專家北京三院張麗珠教授懷抱剛出生的試管嬰兒鄭萌珠2000年，我國(guó)首例超快速冷凍胚胎移植的 試管嬰兒在湖南醫(yī)科大學(xué)誕生。華茲（Ed第一代試管嬰兒：主要特征是模擬體內(nèi)受精過(guò)程，將精子與卵子通過(guò)共培養(yǎng)完成受精。1977年，愛(ài)德 （Edwards）和斯蒂普特(S特(Steptoe))創(chuàng)造的試管嬰兒為第一代試管嬰兒。第二代試管嬰兒：是指采用顯微注射儀將單個(gè)精子注射進(jìn)卵細(xì)胞內(nèi)受精培育的嬰兒。由于使用的是非自然選擇的精子進(jìn)行受精，因此可能將遺傳缺陷傳給下一代，同時(shí)顯微授精操作容易造成卵細(xì)胞損傷。第三代試管嬰兒：經(jīng)過(guò)種植前胚胎遺傳學(xué)基因診斷培育出的試管嬰兒被稱為第三代試管嬰兒。取出部分細(xì)胞進(jìn)行基因診斷，排除帶致病基因的胚胎。第四代試管嬰兒◆借助別人卵漿增強(qiáng)自己卵子活力◆特征：卵漿置換◆主要針對(duì)那些卵子質(zhì)量不高、活力差的高齡女性

超數(shù)排卵?在月經(jīng)周期第3-9d時(shí)，利用促性腺激hMG或CC藥物素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個(gè) 過(guò)程就稱為超數(shù)排卵（superovulation）?

意義：讓每個(gè)供體提供更多的胚胎視頻學(xué)習(xí)網(wǎng)站體外受精/geo/science/v/2009-08-30/151244.shtml試管嬰兒/show/Kkkmb4k0aTQB5xLA.html試管嬰兒制作流程（1）http:///show/7n-wkhQx79vLXe_E.html（2）/show/pzrWIw0I2gGH8bQ_.html（3）/show/SSCD2z_B65Jd4ey_.html（4）/show/_yOTBz3UGm156qho.html（5）/show/YST8onvu-xa5aCUO.html13-4核移植動(dòng)物一定義細(xì)胞核移植（Cellnucleartransfer）是利用顯微操作技術(shù)將一種動(dòng)物的細(xì)胞核移入同種或異種動(dòng)物的去核成熟卵細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)。細(xì)胞核移植動(dòng)物：是用特定發(fā)育階段的核供體及相應(yīng)的核受體（去核的卵子）體外構(gòu)建重組胚，通過(guò)胚胎移植達(dá)到受體，發(fā)育出生的動(dòng)物。理論基礎(chǔ)：動(dòng)物細(xì)胞核具有發(fā)育成個(gè)體的全能性，因此克隆動(dòng)物可以通過(guò)細(xì)胞核移植實(shí)現(xiàn)。但是，細(xì)胞核移植所得到的動(dòng)物為核質(zhì)雜種?？寺?dòng)物一般指采用核移植、胚胎移植技術(shù)得到的動(dòng)物。二核移植動(dòng)物培育技術(shù)流程1-核供體細(xì)胞的獲得與取核2-受體細(xì)胞的去核3-細(xì)胞核移植4-重組胚的激活、培養(yǎng)和移植5-核移植后代的鑒定1核供體細(xì)胞獲得與取核供核細(xì)胞可以是動(dòng)物原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞。分離制備單個(gè)動(dòng)物細(xì)胞，體外培養(yǎng)得到正常二倍體體細(xì)胞系，然后進(jìn)行1～5天的缺血饑餓培養(yǎng)，誘使細(xì)胞處于“靜止”狀態(tài)（一般進(jìn)入G0期）。采用細(xì)胞松弛素B（CytochalasinB）誘發(fā)細(xì)胞排核或者顯微操作取核等方法得到細(xì)胞核。2受體細(xì)胞去核（1）盲吸去核法：用微細(xì)玻璃管吸除處于MII分裂中期的卵細(xì)胞染色體及周圍的部分細(xì)胞質(zhì)。

用熒光染料Hoechst33342對(duì)卵細(xì)胞DNA進(jìn)行染色，在紫外觀察下去核可提高去核成功率。（2）功能性去核法：使用Hoechst33342與卵細(xì)胞DNA結(jié)合后，用紫外線或激光定點(diǎn)照射使核功能喪失。（3）化學(xué)誘導(dǎo)去核法：使用脫羰秋水仙素處理卵細(xì)胞，迫使核染色質(zhì)全部進(jìn)入第二極體細(xì)胞。3細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植可以采用胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射方法。前者是用微吸管吸取供體核后，直接注射進(jìn)卵子細(xì)胞質(zhì)。后者是把細(xì)胞核注射進(jìn)透明帶和卵細(xì)胞間的卵周隙中。核移植方法將受體卵細(xì)胞去核移植后的細(xì)胞激活后可以象受精卵一樣發(fā)育形成動(dòng)物個(gè)體，并具有與核供

體細(xì)胞相同的基因向去核卵細(xì)胞植入供體細(xì)胞核核移植與動(dòng)物克隆4重組胚激活正常受精卵的發(fā)育啟動(dòng)和早期卵裂主要由卵母細(xì)胞胞質(zhì)中母源信息所控制，成熟的卵母細(xì)胞質(zhì)能使移入的細(xì)胞核在形態(tài)上和功能上發(fā)生變化，從而導(dǎo)致供核回復(fù)到初始狀態(tài)，基因從頭開始順序表達(dá)。而核移植重組胚的發(fā)育需要進(jìn)一步激活，可以采用電激活和化學(xué)激活方法。（1）電激活：是可把重組胚放在電融合槽兩極之間，用幾次瞬時(shí)直流脈沖刺激使其激活。（2）化學(xué)激活：常用的激活劑包括7%乙醇、SrCl2、放線菌酮、離子霉素等。鍶5重組胚培養(yǎng)和移植激活后的重組胚可以采用體內(nèi)和體外兩種培養(yǎng)方式。（1）體內(nèi)培養(yǎng)：是將重組胚移植入同種或異種受體動(dòng)物的輸卵管發(fā)育至桑葚胚或囊胚期(8-16cell)，再進(jìn)行胚胎移植至受體動(dòng)物子宮發(fā)育。（2）體外培養(yǎng)：是將重組胚在特定培養(yǎng)液中培養(yǎng)至囊胚，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移入同種的同期發(fā)情的受體動(dòng)物中繼續(xù)發(fā)育。6體細(xì)胞核移植后代的鑒定與出生對(duì)于體細(xì)胞核移植培育的動(dòng)物，可以從形態(tài)性別上鑒定，還可以采用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定。三胚胎細(xì)胞克隆動(dòng)物五體細(xì)胞克隆動(dòng)物體細(xì)胞克?。菏菍?dòng)物體細(xì)胞經(jīng)過(guò)抑制培養(yǎng)使其處于休眠狀態(tài)，利用細(xì)胞核移植技術(shù)將其導(dǎo)入去核卵母細(xì)胞，培育成早期胚胎，將胚胎移植至受體，妊娠產(chǎn)仔培育出與核供體一樣的成體動(dòng)物的一種細(xì)胞工程技術(shù)。意義：由于體細(xì)胞數(shù)量豐富并且易于獲得，因此體細(xì)胞克隆動(dòng)物技術(shù)在加快珍稀動(dòng)物繁殖，搶救瀕危動(dòng)物（如大熊貓），也可以用患者本人細(xì)胞培育出干細(xì)胞或新組織治療方面意義重大。體細(xì)胞克隆基本過(guò)程里程碑式的突破－1997年，英格蘭愛(ài)丁堡羅斯林研究所和PPL制藥公司利用高度分化的綿羊乳腺上皮細(xì)胞，通過(guò)核移植克隆了一只雌性小綿羊——Dolly多莉。這是第一個(gè)體細(xì)胞克隆動(dòng)物。證明：成熟的體細(xì)胞也具有全能性。多莉羊技術(shù)路線1-核供體細(xì)胞獲得與取核取一只6歲已妊娠到后期的白色的芬蘭多特西母羊的乳腺組織，酶消化分解成單個(gè)細(xì)胞，將這些細(xì)胞平鋪在新鮮的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)層（滋養(yǎng)層）上培養(yǎng)7天，將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到卻乏營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)傳代，其培養(yǎng)基的胎牛血清濃度從10%下降至0.5%，這樣使細(xì)胞停在休止期（G0）。（傳到7-9代時(shí)，供體細(xì)胞可停在休止期，此時(shí)細(xì)胞染色體為54個(gè)，是二倍體）。在倒置顯微鏡下，用顯微吸管將核吸出。2-卵細(xì)胞收集與去核受體卵細(xì)胞來(lái)自于蘇格蘭黑面母綿羊，在注射促性腺釋放素(GnRH)28-33h時(shí)，收集卵細(xì)胞。在倒置顯微鏡的視野下用顯微吸管刺入，吸取中期染色體和少量細(xì)胞質(zhì)。去核后卵細(xì)胞放在無(wú)鈣鎂，但含有1%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中復(fù)原，然后轉(zhuǎn)移到37度無(wú)鈣、但含有10%的胎牛血清的M2培養(yǎng)液中保存?zhèn)溆谩?-細(xì)胞核融入卵細(xì)胞構(gòu)建重組胚將核和已去核卵細(xì)胞放入同一培養(yǎng)皿中，在交變脈沖電壓為3伏的電場(chǎng)中融合5分鐘，再用1.25千伏/厘米，80微秒，直流電脈沖3次，將乳腺細(xì)胞核融入卵中形成一個(gè)含有新遺傳物質(zhì)的卵細(xì)胞，稱之為重組胚。4-重構(gòu)胚的培養(yǎng)與移植將重構(gòu)胚種植在綿羊結(jié)扎的輸卵管中培養(yǎng)，大約培養(yǎng)6天后，大多數(shù)胚胎發(fā)育到桑椹期或囊胚期（8－16個(gè)細(xì)胞）。再選擇發(fā)育優(yōu)良的重構(gòu)胚移植到蘇格蘭黑綿羊的子宮中，每只受體母羊移植1-3個(gè)重組胚。5-妊娠發(fā)育監(jiān)護(hù)與出生妊娠60天時(shí)用超聲波診斷妊娠。每?jī)芍苓M(jìn)行一次全方位監(jiān)護(hù)胎兒發(fā)育。分娩時(shí)由獸醫(yī)外科醫(yī)生助產(chǎn)。產(chǎn)下多莉即為6歲母羊的復(fù)制品，也為白色。獼猴特拉2000年成功克隆了一只叫做特拉的獼猴克隆豬2000年美國(guó)一家生物公司克隆了5頭雌性豬，用于生長(zhǎng)出適合人類的器官和細(xì)胞組織。老鼠庫(kù)姆利納2000年美國(guó)成功克隆一只老鼠，這只老鼠被命名為“庫(kù)姆利納”

(Cumulina)，它一直存活了兩年7個(gè)月。母牛諾托和卡加1998年日本成功克隆兩頭母牛，隨后克隆了數(shù)千頭母牛，為生產(chǎn)出更好的肉質(zhì)和牛奶。兔子2001年科學(xué)家成功克隆出兔子?？寺∝埧飘?001年成功克隆，從此開辟了寵物克隆市場(chǎng)。克隆馬普羅梅蒂亞2003年意大利克隆出一只叫做普羅梅亞的種馬?？寺÷苟磐?003年美國(guó)德克薩斯州農(nóng)業(yè)機(jī)械大學(xué)成功克隆了一只白尾鹿，并取名為杜威。目的是用于研究鹿基因，并形成更好的鹿基因。克隆狗史努比2005年韓國(guó)科學(xué)家利用干細(xì)胞移植手術(shù)培育出世界上第一只克隆狗，并將這只克隆狗命名為史努比。13-5冷凍保存技術(shù)

1.胚胎冷凍技術(shù)

2.精子冷凍技術(shù)

3.卵細(xì)胞冷凍保存技術(shù)

1.胚胎冷凍技術(shù)◆關(guān)鍵是減少細(xì)胞內(nèi)冰晶對(duì)胚胎造成的損傷◆抗凍保護(hù)劑（1）滲透型細(xì)胞內(nèi)冷凍劑：甘油、DMSO、乙二醇等，進(jìn)入細(xì)胞排除細(xì)胞水份，降低電解質(zhì)濃度，提高了細(xì)胞耐凍性。（2）非滲透型細(xì)胞外冷凍劑：改變滲透壓引起細(xì)胞脫水，包括葡萄糖、蔗糖、棉子糖、PVP等?！衾鋬霰Ｗo(hù)液：常用pH7.2-7.4PBS或生理鹽水或M199來(lái)配制。◆冷凍方法：玻璃細(xì)管緩慢冷凍法

玻璃化冷凍法：由于冷凍劑溶液在低溫時(shí)變粘稠，形成一種特殊的無(wú)定形“玻璃化”固液之間狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)外水份都不形成結(jié)晶損傷，從而使胚胎在急劇的降溫過(guò)程中得以存活。復(fù)蘇：解凍時(shí)則以較快的速率升溫（快融），使胚胎瞬間通過(guò)危險(xiǎn)溫區(qū)（-50-0℃），然后脫除對(duì)胚胎細(xì)胞有一定傷害作用的冷凍保護(hù)劑。

2.精子冷凍保存◆常溫保存：15~25℃

低溫保存：0~5℃

冷凍保存：-79℃干冰、-196℃液氮

3.卵細(xì)胞冷凍保存◆比胚胎和精子保存難度大◆常采用兩步法玻璃化冷凍保存法13-6動(dòng)物性別控制所謂性別控制，就是通過(guò)人為干預(yù)或操作手段使母畜繁殖所需要的后代。多數(shù)動(dòng)物的性別是由性染色體決定的。以人為例：XX——女；XY——男在人Y染色體短臂發(fā)現(xiàn)了一個(gè)單拷貝基因，稱為Y染色體性別決定區(qū)基因（SexdeterminingregionYgene，SRY）Y染色體短臂上一段SRY基因決定人的性別。SRY基因啟動(dòng)雄性器官的發(fā)育。XX染色體缺少SRY基因，染色體上DSS位點(diǎn)基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)卵巢發(fā)育，形成雌性。性別決定機(jī)制性別控制途徑性別控制主要有兩條途徑：1-受精前性別控制：選擇X、Y精子2-胚胎移植前性別控制：在移植前對(duì)胚胎進(jìn)行性別鑒定，然后對(duì)所需要性別的胚胎進(jìn)行移植，從而達(dá)到控制后代性別的目的，這是動(dòng)物性別控制較為實(shí)用的方法。

選擇相應(yīng)的X或Y雄性配子，進(jìn)行體外受精，就可以實(shí)現(xiàn)性別控制。X-Y精子在物理和化學(xué)上存在差異，例如：精子的耐酸堿性：Y精子有嗜堿性，而X精子有嗜酸性?？梢圆捎靡韵路椒ǚ蛛xX/Y精子：（1）離心分離法X精子DNA含量略大于Y精子，因此X精子密度較Y精子略大，因此可以采用離心分離。優(yōu)點(diǎn)：是分離時(shí)間短、對(duì)精子損傷小。缺點(diǎn)：是因?yàn)閄、Y精子密度相差不大（0.007g/m3），分離困難，對(duì)儀器精度要求高。1-受精前性別控制：X-Y精子的分離（3）電泳分離法利用精子表面電荷差異采用電泳進(jìn)行分離。精子帶負(fù)電荷，Y精子負(fù)電荷略小于X精子，因此在中性緩沖液中，X精子向陽(yáng)極移動(dòng)的速度較快。優(yōu)點(diǎn)是操作方便，缺點(diǎn)是分離效率不高。（2）免疫學(xué)分離法Y精子上存在雄性特異性組織相容性抗原（H-Y抗原），利用H-Y抗體檢測(cè)精子質(zhì)膜上是否存在HY抗原，以此分離X精子（H-Y抗原陰性）和Y精子（H-Y抗原陽(yáng)性）。主要有免疫親和柱層析法和免疫磁珠法。目前這個(gè)方法僅限于小規(guī)模實(shí)驗(yàn)研究，準(zhǔn)確性較低。（4）流式細(xì)胞儀分離法根據(jù)X、Y精子上DNA含量的微小差別，通過(guò)流式細(xì)胞儀(Flowcytometer)進(jìn)行分離。首先將精子稀釋并與熒光染料Hoechst33342混合，這種染料可以定量地與DNA結(jié)合。精子通過(guò)檢索儀時(shí)被激光束激發(fā)，由于X精子比Y精子含較多的DNA，X精子放射出較強(qiáng)的熒光信號(hào)。放射出的信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分辨X精子和Y精子。借助兩塊各自帶正電或負(fù)電的偏斜板，把X或Y精子分別引導(dǎo)到2個(gè)收集管中。2胚胎移植前性別鑒定細(xì)胞生物學(xué)方法：通過(guò)判定胚胎細(xì)胞性染色體是Ｘ還是Ｙ來(lái)鑒定胚胎的性別。分子生物學(xué)方法：根據(jù)Y染色體上的SRY基因的有無(wú)進(jìn)行鑒別，可以采用PCR或FISH等分子方法進(jìn)行確定性別。生化免疫學(xué)方法：H-Y抗原檢測(cè)法對(duì)于人類，世界范圍內(nèi)不孕夫婦占10％左右，中國(guó)約有4000萬(wàn)夫婦不能孕育，需要建立人工助孕技術(shù)。視頻：體外受精嬰兒/geo/science/v/2009-08-30/151244.shtml動(dòng)物人工繁殖的技術(shù)方法一覽：體細(xì)胞、成體干細(xì)胞雌性動(dòng)物雄性動(dòng)物核移植卵子精子人工授精體外受精胚胎重組胚有性生殖途徑無(wú)性生殖途徑

胚胎細(xì)胞胚胎培養(yǎng)胚胎冷凍胚胎分割胚胎移植 受體動(dòng)物 發(fā)育出生克隆有關(guān)倫理學(xué)問(wèn)題討論討論題：1-動(dòng)物可以無(wú)休止地被克隆嗎？2-你是否同意生殖性克隆？無(wú)性生殖是否是人類的倒退？3-英雄、偉人可以通過(guò)克隆再生嗎？問(wèn)題1：克隆羊多莉剛出生時(shí)，它的染色體顯示已經(jīng)有好幾歲了。2003年它已經(jīng)永遠(yuǎn)離開了我們。6歲。供體6歲。蘇格蘭羅斯林研究院的科學(xué)家們對(duì)多莉的染色體做了仔細(xì)的研究，發(fā)現(xiàn)其染色體末端端粒比同齡的普通綿羊短。端粒是決定細(xì)胞老化的主要因素，端粒越短的細(xì)胞越接近死亡。變短的端?；蛟S表明遺傳的藍(lán)本會(huì)隨著時(shí)間流逝而老化，無(wú)休止地克隆一個(gè)動(dòng)物是不可能的。關(guān)于端粒每一條染色體的末端都有特殊的結(jié)構(gòu)叫端粒(telomere)。它可以保持染色體的穩(wěn)定性，丟失了端粒的染色體很容易和別的染色體相接形成雙著絲粒染色體或自身首尾相聯(lián)形成環(huán)狀染色體，前者在減數(shù)分裂后期會(huì)產(chǎn)生染色體橋(chromosomebridge)，最終引起染色體的重復(fù)與缺失。生殖細(xì)胞可以重建與延長(zhǎng)端粒的DNA；而體細(xì)胞則隨著復(fù)制次數(shù)的增加端粒DNA會(huì)逐漸縮短。Harley等（1989年）用人的端粒重復(fù)片段為探針對(duì)胎兒、新生兒、青年和老年人的細(xì)胞株的端粒長(zhǎng)度進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，人成纖維細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度不斷下降。因此端粒DNA可能決定了細(xì)胞的壽命，并與細(xì)胞的自然凋亡與癌變密切相關(guān)。1990年Harely等則認(rèn)為端粒的長(zhǎng)度可反映細(xì)胞有絲分裂的次數(shù)。端粒象是細(xì)胞分裂的“計(jì)數(shù)器”。問(wèn)題2：許多國(guó)家出臺(tái)法律禁止生殖性克隆。有性生殖是歷史進(jìn)化的結(jié)果，利于種族繁衍和生存，以及優(yōu)良性狀的形成。選擇無(wú)性生殖——克隆的方式不利于遺傳多樣性的保護(hù)。從有性繁殖到無(wú)性繁殖，就進(jìn)化而言是一種退化?？寺?dòng)物存在的問(wèn)題 （1）技術(shù)尚不成熟得到的克隆動(dòng)物具有極大的偶然性和隨機(jī)性。迄今為止，克隆試驗(yàn)的成功率始終很低。例如，在培育多莉的過(guò)程中，科學(xué)家共克隆出２７７個(gè)綿羊胚胎，最終成功使母羊受孕并生產(chǎn)的只有多莉一個(gè)。目前，多莉羊的制備還不能重復(fù)，更不能肯定克隆多莉羊的方法也適用于其它動(dòng)物或其它不同組織器官的細(xì)胞。（2）遺傳、疾病問(wèn)題克隆動(dòng)物夭折率高，不少克隆動(dòng)物天生患有疾病或體形過(guò)大?？寺⊙蚝涂寺∨６加畜w形過(guò)度龐大的問(wèn)題。該缺陷在克隆鼠身上也存在。克隆牛、羊、豬都存在發(fā)育不良、免疫系統(tǒng)缺陷和心肺功能不健全的問(wèn)題?？寺?dòng)物沒(méi)有遺傳物質(zhì)的交流和互補(bǔ)，