無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的福音

無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的福音——孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)技術(shù)周思前篩查與診斷是婦產(chǎn)科保健的重要部分，對(duì)正常懷孕的婦女，通過孕期檢查時(shí)的病史詢問、母血清生化指標(biāo)的檢測(cè)、超聲影像學(xué)的檢查篩選出一部分高風(fēng)險(xiǎn)人群，再針對(duì)此組人群選擇適宜的方法進(jìn)行相關(guān)的產(chǎn)前診斷。傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法一般都具有創(chuàng)傷性，有發(fā)生感染、出血甚至流產(chǎn)、死胎的可能。無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷長久以來致力于利用孕婦外周血中存在的胎兒有核細(xì)胞，但由于母體外周血中胎兒有核細(xì)胞極少，其分離、富集方法繁瑣復(fù)雜，且價(jià)格昂貴，其臨床應(yīng)用至今不能推廣。孕婦外周血中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷帶來了新的希望。一、技術(shù)原理孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)技術(shù)的具體操作為：采集孕婦外周血10ml于EDTA抗凝管中，樣本收集后4℃條件下進(jìn)行血漿分離，提取血漿中游離DNA，PCR擴(kuò)增，獲得對(duì)應(yīng)樣本的DNA文庫，高通量檢測(cè)，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。1、胎兒游離DNA的制備：在胎兒游離DNA提取過程中，血樣的放置時(shí)間、抗凝劑的使用、離心速度等都會(huì)影響提取DNA的量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性。放置時(shí)間對(duì)DNA總量有影響，而對(duì)胎兒游離DNA無影響，胎兒游離DNA在抽血后24h內(nèi)都是穩(wěn)定的，總DNA的增加可能是由于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡和溶解引起的母源DNA的增加。DNA總量與胎兒游離DNA檢出的敏感性有關(guān)，母親DNA量的增加會(huì)降低拷貝數(shù)目胎兒游離DNA的檢出。在血液樣本抗凝劑的選擇方面，大多數(shù)學(xué)者選用EDTA來抗凝，經(jīng)證實(shí)，6h內(nèi)EDTA和肝素、檸檬酸鈉效果無明顯差別；而血樣放置超過6h，EDTA的效果優(yōu)于肝素和檸檬酸鈉等抗凝劑。目前胎兒游離DNA一般采用2次離心之后取上層血漿用試劑盒來提取，然后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)胎兒游離DNA進(jìn)行定量分析。第一次離心速度一般為1600×g左右，主要目的是將存在于血漿中的細(xì)胞沉淀初步分離出來同時(shí)又要防止細(xì)胞破損導(dǎo)致基因組DNA釋放到血漿中。第二次離心一般為13000～16000×g的高速離心，進(jìn)一步將殘留血細(xì)胞去除。離心速度對(duì)胎兒游離DNA的提取至關(guān)重要，離心速度過快或在提取DNA之前血液放置時(shí)間過久都會(huì)導(dǎo)致完整細(xì)胞破壞溶解，從而母血DNA量增加，造成胎兒游離DNA的相對(duì)稀釋，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)如實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)其的檢測(cè)。因此胎兒游離DNA提取時(shí)應(yīng)盡量減少血樣放置時(shí)間，以減少細(xì)胞壞死和溶解，提高胎兒游離DNA的檢出率。2、PCR技術(shù)：孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)技術(shù)中的關(guān)鍵步驟其實(shí)是PCR擴(kuò)增，雖然該技術(shù)較為普遍廣知，仍舊單獨(dú)對(duì)該技術(shù)的基本原理作一介紹。PCR技術(shù)是模擬體內(nèi)DNA的天然復(fù)制過程，在體外擴(kuò)增DNA分子的一種分子生物學(xué)技術(shù)，主要用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。在待擴(kuò)增的DNA片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2?倍。PCR的每個(gè)循環(huán)過程包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個(gè)不同的事件：①變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃左右）雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈；②退火；使溶液溫度降至50~60℃，模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合；③延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5'一3’方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA。3、胎兒游離DNA的檢測(cè)：①檢測(cè)繼承自父親一方的基因或突變。目前對(duì)孕婦外周血中胎兒游離DNA的應(yīng)用大多局限于檢測(cè)胎兒從父親一方繼承來的基因或突變，如Y染色體上的SRY、DYS14基因，Rh抗原基因等。②利用表觀遺傳學(xué)檢測(cè)從母親繼承來的胎兒等位基因。由于母親外周血中的胎兒DNA處于一種高母體DNA的背景下，這使得檢測(cè)從母親繼承來的胎兒等位基因曾被認(rèn)為是不可能的，但近來表觀遺傳學(xué)的發(fā)展提供了打破這些限制的可能。表觀遺傳學(xué)是指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變，即基因型未變而表型卻發(fā)生了改變。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)也是最重要的基因表觀修飾方式之一。2005年Chim等研究發(fā)現(xiàn)，maspin基因在胎盤細(xì)胞中處于低甲基化，而在母血細(xì)胞中處于高甲基化，這種不同甲基化狀態(tài)為其作為母血漿中胎兒游離DNA的篩選標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，血漿中低甲基化的maspin序列中存在胎兒SNPs基因型。應(yīng)用胎兒與母體DNA甲基化差異聯(lián)合等位基因比例可用來無創(chuàng)診斷胎兒染色體異常疾病，如18-三體、21-三體征。這表明，表觀遺傳學(xué)的方法能夠用來發(fā)展孕期通用的胎兒DNA標(biāo)記，且不受胎兒性別和胎兒與母親遺傳多態(tài)性的影響。二、技術(shù)應(yīng)用1、胎兒性別鑒定。利用孕婦血漿胎兒DNA進(jìn)行性別判定對(duì)排除X連鎖遺傳病具有重要意義。應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，通過胎兒DNA判斷胎兒性別已經(jīng)達(dá)到很高的靈敏度。Honda等先通過常規(guī)PCR檢測(cè)13～14周孕齡的胎兒性別，敏感性達(dá)100%，后用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)5周孕齡的胎兒性別，敏感性也接近100%。通過性別判定，可進(jìn)一步排除患性連鎖遺傳病的風(fēng)險(xiǎn)。Bartha等從妊娠6周的孕婦血漿中檢出了男性胎兒的SRY基因，從而排除了女性胎兒因21-羥化酶缺陷而患上先天性腎上腺增生的危險(xiǎn)性。肌營養(yǎng)不良癥是常見的X連鎖隱性遺傳病，利用游離胎兒DNA進(jìn)行胎兒性別鑒定后，只需對(duì)孕男胎的婦女進(jìn)行創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷，避免了孕女胎婦女進(jìn)行創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷導(dǎo)致的不必要的流產(chǎn)致畸風(fēng)險(xiǎn)。2、胎兒RhD血型判斷。RHD-的孕婦如果第二胎生育RHD+的胎兒，就有可能引起胎兒紅細(xì)胞破壞，進(jìn)而出現(xiàn)嚴(yán)重的貧血癥狀，所以對(duì)RHD-孕婦產(chǎn)前胎兒的RhD血型檢測(cè)非常重要，并對(duì)孕婦的抗D免疫球蛋白治療方案有重要指導(dǎo)意義。胎兒游離DNA的方法很早就被應(yīng)用于胎兒RhD血型的檢測(cè)。目前，此項(xiàng)技術(shù)的敏感度有了很大提高。Chinena等對(duì)97名RHD-的孕婦進(jìn)行胎兒RhD血型檢測(cè)，對(duì)RHD基因的第7外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，敏感度達(dá)到100%，特異性90.9%，假陰性0%。3、妊娠相關(guān)疾病篩查。一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，很多妊娠相關(guān)疾病都伴隨胎兒游離DNA濃度的增加，如早產(chǎn)、先兆子癇、妊娠劇吐、侵入性胎盤等。其中研究最多最深入的是先兆子癇。在先兆子癇患者中，胎兒游離DNA的量高于正常孕婦，且胎兒游離DNA的升高使先兆子癇癥狀出現(xiàn)的時(shí)間提前，而且升高的程度和先兆子癇的嚴(yán)重性相關(guān)。所以胎兒游離DNA可能是一種有應(yīng)用價(jià)值潛力的先兆子癇患者篩檢物。4、染色體疾病篩查。隨著母血中DNA分離和檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)，胎兒游離DNA成為檢測(cè)非整倍體疾病的一項(xiàng)參考指標(biāo)。Go等首先發(fā)現(xiàn)了母血漿中存在21號(hào)染色體特異表達(dá)mRNA片段LOC90625，這為通過定量檢測(cè)mRNA的表達(dá)異常來篩查唐氏綜合征提供了可能。Lau等也在母血漿中發(fā)現(xiàn)了位于21號(hào)染色體上胎盤特異表達(dá)的PLCA4基因片段。為了通過mRNA來說明21號(hào)染色體含量上的差異，Lau等選擇了PLCA4編碼區(qū)域一個(gè)SNP位點(diǎn)，由于在一個(gè)正常胎兒，人類染色體的二倍體性使得雜合性SNP其等位基因含量比例將會(huì)出現(xiàn)1：1，而對(duì)于一個(gè)21-三體患兒，其等位基因的含量比例將會(huì)為1：2或2：1。因此可以用母血漿中胎盤表達(dá)的mRNA來無創(chuàng)性的評(píng)估胎盤細(xì)胞染色體含量的異常與否，也可以評(píng)估胎兒染色體數(shù)目異常與否。前述2005年Chim等發(fā)現(xiàn)的在胎盤細(xì)胞中處于低甲基化狀態(tài)而母血細(xì)胞中高甲基化狀態(tài)的maspin基因，為表觀遺傳學(xué)用于發(fā)展孕期通用的胎兒DNA標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)，在此研究思路下，Tong等通過對(duì)母血漿中maspin基因進(jìn)行表觀遺傳學(xué)檢測(cè)并對(duì)低甲基化的maspin基因序列上的等位基因進(jìn)行了分析，由于maspin基因位于18號(hào)染色體，即可對(duì)18-三體的存在進(jìn)行確認(rèn)。唐氏綜合征由于其發(fā)病率高而備受人們關(guān)注，為了尋找21號(hào)染色體可用診斷的表觀遺傳標(biāo)記，Hultén等采取了3種策略篩選差異甲基化的DNA序列：(1)在母血細(xì)胞和胎兒中高度差異表達(dá)基因的啟動(dòng)子序列；(2)隨機(jī)的啟動(dòng)子區(qū)域；(3)隨機(jī)的非啟動(dòng)子區(qū)域。用甲基化特異性限制性酶分析了200多個(gè)候選DNA序列，結(jié)果在21q22.3發(fā)現(xiàn)了3個(gè)差異甲基化序列：AIRE、SIM2和ERG基因。其中AIRE基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG位點(diǎn)是高度差異甲基化的，可作為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷唐氏綜合征重要的候選表觀遺傳標(biāo)記。5、單基因遺傳病篩查。單基因遺傳病是我國常見出生缺陷的重要原因之一，較為常見且研究較多的有地中海貧血、苯丙酮尿癥、肝豆?fàn)詈俗冃?、葡萄?6-磷酸脫氫酶缺陷、軟骨發(fā)育不良、囊性纖維化等。除部分單基因遺傳病可通過手術(shù)加以矯正外，絕大部分是致死、致殘、致畸性疾病，且目前均無法治療，產(chǎn)前診斷則是避免致死、致殘、致畸性疾病胎兒出生的重要手段。在β珠蛋白生成障礙性貧血的診斷中，Galbiati等采用PNA鉗夾術(shù)(PNA-clamping)，以微電子芯片技術(shù)對(duì)32例孕婦診斷中通過檢測(cè)7個(gè)常見的β珠蛋白突變得到100%的準(zhǔn)確度和98.3%的特異性，這一研究日后若應(yīng)用于臨床，將對(duì)出生前臨床干預(yù)具有重大指導(dǎo)意義。三、技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法一般采用羊膜腔穿刺、絨毛膜取樣和臍靜脈穿刺等，它們都具有創(chuàng)傷性，有發(fā)生感染、出血甚至流產(chǎn)、死胎的可能。長久以來人們致力于利用孕婦外周血中存在的胎兒有核細(xì)胞進(jìn)行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，但由于母體外周血中胎兒有核細(xì)胞極少，每毫升血中僅有1～2個(gè)，其分離、富集方法繁瑣復(fù)雜，且價(jià)格昂貴，其臨床應(yīng)用至今不能推廣。孕婦外周血中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷帶來了新的希望，胎兒游離DNA含量相對(duì)高，提取及分析過程簡單，易于發(fā)展為可應(yīng)用于臨床的大樣本高通量的檢測(cè)方法。抽取孕婦外周血檢測(cè)胎兒游離DNA來進(jìn)行產(chǎn)前診斷，無創(chuàng)傷取樣，準(zhǔn)確率高、靈敏度高、特異性強(qiáng)，且結(jié)果不受母體孕周（孕12周后即可檢測(cè)）、生育年齡等因素影響，不會(huì)對(duì)孕婦及胎兒產(chǎn)生傷害。另外胎兒DNA分娩后很快被清除，不會(huì)受前次妊娠的影響。無創(chuàng)性產(chǎn)前基因檢測(cè)不僅能夠提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率與效率，而且消除了傳統(tǒng)檢測(cè)方法給人們帶來的精神負(fù)擔(dān)。因此，對(duì)孕婦外周血中胎兒游離DNA的檢測(cè)及其臨床應(yīng)用研究將對(duì)無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生重大影響。同時(shí)，將基因組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷，也將更好地加強(qiáng)我國出生缺陷的二級(jí)預(yù)防。缺點(diǎn)：1、盡管胎兒游離DNA具有眾多的優(yōu)勢(shì)，但仍存在一些問題有待解決，如胎兒游離DNA的來源及清除機(jī)制還不甚清楚。關(guān)于胎兒DNA的來源與釋放機(jī)制研究：一般認(rèn)為胎兒游離DNA釋放到母血中的機(jī)制可能有以下3種。(1)胎兒有核細(xì)胞進(jìn)入母體外周血后發(fā)生凋亡釋放出游離DNA。妊娠期進(jìn)入母體血循環(huán)的胎兒細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和有核紅細(xì)胞等。胎兒細(xì)胞有穿越絨毛毛細(xì)血管內(nèi)皮和滋養(yǎng)層基膜的現(xiàn)象，胎兒細(xì)胞在穿越胎盤時(shí)可能發(fā)生凋亡。因此孕婦血漿中的游離胎兒DNA可來源于進(jìn)入母體血的胎兒有核細(xì)胞。但無法解釋母體外周血中胎兒細(xì)胞很少而血漿中游離胎兒DNA含量豐富。(2)胎兒DNA經(jīng)母-胎界面進(jìn)入母血。游離胎兒DNA在羊水中的濃度近乎于母體血漿中的200倍，推測(cè)濃度梯度可能導(dǎo)致DNA分子的直接傳輸。雖然在臍血漿中可測(cè)得母源性DNA，但僅占胎兒血循環(huán)總游離DNA的0.9%(0.2%～8.4%)，而母血中胎兒游離DNA占母體血循環(huán)總游離DNA的14.3%(2.3%～64%)，說明游離DNA雖可直接穿越胎盤屏障，但此來源的可能也很少。(3)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡后釋放游離的胎兒DNA。該說法獲得了較多的實(shí)驗(yàn)支持。胎盤滋養(yǎng)層是母體與胎兒之間進(jìn)行物質(zhì)交換的胎源組織，早期胚胎的滋養(yǎng)層發(fā)育很快，孕4周時(shí)滋養(yǎng)層間隙即被母血所充盈，滋養(yǎng)層細(xì)胞可侵入到子宮基層甚至充當(dāng)子宮螺旋小動(dòng)脈的管壁，所以，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞可直接深入母血中。許多研究表明整個(gè)正常妊娠期都存在著胎盤細(xì)胞的凋亡，晚期胎盤細(xì)胞的凋亡更加明顯，而且滋養(yǎng)層細(xì)胞占凋亡細(xì)胞的大多數(shù)(>50%)。滋養(yǎng)層細(xì)胞的不斷凋亡對(duì)胎盤的正常發(fā)育、維持胎盤的組織結(jié)構(gòu)和功能完整性具有重要作用。妊娠最早期的胎盤形成處于相對(duì)缺氧的環(huán)境，最近的研究發(fā)現(xiàn)缺氧使滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加，釋放含有DNA的膜包裹凋亡小體。先兆子癇的患者由于胎盤淺著床而導(dǎo)致絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞缺氧損傷，進(jìn)而誘發(fā)大量絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞在正常生理和病理狀況下的凋亡和損傷是母血中胎兒DNA的重要來源。2、針對(duì)染色體疾病篩查，該方法目前因費(fèi)用高，還不能廣泛應(yīng)用普及；同時(shí)此技術(shù)只能檢測(cè)胎兒染色體拷貝數(shù)異常，對(duì)于染色體中的嵌合體、易位型、微缺失、微重復(fù)等結(jié)構(gòu)異常則不能檢出，這將是研究者們今后努力的方向。3、需要尋找更多的胎源性DNA標(biāo)記物來診斷臨床眾多的遺傳病及妊娠相關(guān)疾病。參考文獻(xiàn)：[1]王文博,張毅,孫樹漢.孕婦外周血中胎兒游離DNA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,30(04):442-446.[2]陸海燕,鄭建麗,楊芳芳,許孟軍,管永娟,周云,張曄,季葉霞,王鳳,施陽寧.孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2014,22(10):78-79+8.[3]王靖,陳漢平.母體外周血中的游離胎兒核酸物質(zhì)在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的研究進(jìn)展[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2010,18(11):3-5.[4]BischoffFZ,LewisDE,SimpsonJL.CellfreefetalDNAinmaternalblood:kinetics,sourceandtructure[J].HumReprodUpdate,2005,11:59-67.[5]AngertRM,LeShaneES,LoYM,ChanLY,Delli-BoviLC,BianchiDW.Fetalcell-freeplasmaDNAconcentrationsinmaternalbloodarestable24hoursaftercollectionanalysisoffirstandthird-trimestersamples[J].ClinChem,2003,49:195-198.[6]LamNY,RainerTH,ChiuRW,LoYM.EDTAisabetteran-ticoagulantthanheparinorcitratefordelayedbloodprocessingforplasmaDNAanalysis[J].ClinChem,2004,50:256-257.[7]ChimSS,TongYK,ChiuRW,LauTK,LeungTN,ChanLY,etal.Detectionoftheplacentalepigeneticsignatureofthemaspingeneinmaternalplasma[J].ProcNatlAcadSciUSA,2005,102:14753-14758.[8]BarthaJL,Finn