中藥密蒙花化學(xué)成分研究

中藥密蒙花化學(xué)成分研究

常用的中藥是密蒙花，它是治療眼睛疾病的常用藥物。《中華人民共和國藥典》2000年版規(guī)定密蒙花為馬錢科醉魚草屬植物BuddlejaofficinalisMaxim.的干燥花蕾及其花序。醉魚草屬植物在全世界約有100多種,本屬的藥用植物比較多。國內(nèi)外學(xué)者對本屬其他藥用植物的化學(xué)成分和生物學(xué)活性方面作了較多的研究,但對于密蒙花在這兩方面的研究則相對較少。為了闡明密蒙花中的有效成分及作用機制,找到活性單體,為藥材的質(zhì)量控制及其新藥的研究與開發(fā)提供科學(xué)依據(jù),本實驗采用現(xiàn)代光譜和波譜技術(shù)對其中的化學(xué)成分進行了系統(tǒng)研究,并結(jié)合其功效對提取部位和分離到的化學(xué)成分進行了體外生物學(xué)活性的篩選,以期發(fā)現(xiàn)活性天然產(chǎn)物以及明確活性機制。色譜-質(zhì)譜條件X4型顯微熔點測定儀(溫度計未校正);AEI—MS—50質(zhì)譜儀;JEOLAlice300M、VarianINOVA500型核磁共振波譜儀。分析用Agilent1100型高效液相色譜儀(包括在線脫氣、四元泵、柱溫箱、自動進樣器、二級管陣列檢測器、AgilentChemstation);制備用JASCOPl00型高效液相色譜儀,JASCOUV100型紫外檢測器。D101大孔樹脂(天津制膠廠);柱色譜用硅膠(200～300目,青島海洋化工廠);SephadexLH-20(25～100μm,Pharmacia公司);反相硅膠ODS(FujiSilysiaCo.Ltd.,日本);硅膠預(yù)制薄層板(青島海洋);反相硅膠薄層板(MerckCo.);聚酰胺薄膜(浙江黃巖);SenshuHPLC制備色譜柱(ODS,5μm,20mm×250mm);InertsilODS-3C18色譜柱(5μm,250mm×4.6mm,Gl-Science.Co.Ltd.);顯色劑為5%硫酸乙醇溶液,5%三氯化鋁乙醇溶液。其余溶劑均為分析純產(chǎn)品。密蒙花B.officinalisMaxim.藥材購自安徽亳州,經(jīng)郭洪祝副教授鑒定,標(biāo)本存放于本室。2分析方法表1密蒙花藥材30kg,95%乙醇滲漉提取,提取液濃縮,用水分散后分別以石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取,得到4個部位。取醋酸乙酯部分100g,經(jīng)硅膠柱色譜,氯仿-甲醇梯度洗脫;反相柱色譜,甲醇-水梯度洗脫;得到各流份,其中2～6流份經(jīng)過制備液相,甲醇-水(40:60)洗脫得到淡黃色粉末V(4g),7～9流份經(jīng)過制備液相和凝膠柱SephadexLH-20得到兩個淡黃色粉末Ⅵ(21mg)和Ⅲ(65mg),10流份析出白色粉末Ⅳ(18mg);F6部位經(jīng)過反相柱色譜和制備液相,得到兩對淡黃色粉末物質(zhì)Ⅶ-1、2和Ⅷ-1、2,液相檢查為兩對難以分離的峰,薄層檢識在紫外燈下為亮藍(lán)色熒光,提示可能為兩對異構(gòu)體混合物。取正丁醇部位120g,加水分散,經(jīng)大孔吸附樹脂色譜,水-乙醇梯度洗脫。其中80%乙醇洗脫部位40g,經(jīng)過硅膠柱色譜,醋酸乙酯-甲醇梯度洗脫得到各流份。其中,F2經(jīng)過硅膠柱色譜(石油醚-丙酮梯度洗脫),11流份析出淡黃色粉末,丙酮重結(jié)晶后得到Ⅰ(15mg);F7中位經(jīng)過硅膠柱色譜(氯仿-甲醇梯度洗脫),在9-10流份析出白色粉末Ⅱ(500mg);11-12流份liberman反應(yīng)強烈,經(jīng)過凝膠柱SephadexLH-20和制備液相,分別得到白色晶體Ⅸ(10mg)、白色粉末Ⅺ(12mg)和白色粉末Ⅹ(20mg)。3化合物結(jié)構(gòu)鑒定化合物I:淡黃色粉末,易溶于氯仿,微溶于甲醇。硫酸顯紫紅色。HCl-Mg反應(yīng)陽性,其紫外圖譜顯示254,340nm處有最大吸收。碳譜數(shù)據(jù)見表1。推測其結(jié)構(gòu)為:5,7,4′-trihydroxyflavone,即芹菜素,經(jīng)過與文獻(xiàn)對照,基本一致?；衔铫?淡黃色無定型粉末,易溶于甲醇。UVnm:200、265、335。碳譜數(shù)據(jù)見表1。推測該化合物結(jié)構(gòu)為acaetin-7-O-α-L-rhamnopyranosyl(1-6)-β-D-glucopyranoside,即密蒙花苷,經(jīng)過與文獻(xiàn)對照,數(shù)據(jù)基本一致。化合物Ⅲ:淡黃色無定型粉末,易溶于甲醇,不溶于氯仿、丙酮。TOF-MS(negativeion):m/z577.2[M—H]。UV:200、254、340。碳譜數(shù)據(jù)見表1。推斷該化合物結(jié)構(gòu)為:apigenin-7-O-α-L-rhamnopyranosyl(1-6)-β-D-glucopyranoside,即芹菜素-7-O-蕓香糖苷。與文獻(xiàn)對照基本一致?；衔铫?白色粉末,不溶于甲醇、水、氯仿、丙酮,易溶于DMSO-d6。UVnm:215、254、355。碳譜數(shù)據(jù)見表1。確定該化合物結(jié)構(gòu)為木犀草素7-O-葡萄糖苷,經(jīng)過與文獻(xiàn)對照,基本一致?；衔颲:淡黃色無定型粉末,易溶于甲醇和水,不溶于氯仿、丙酮。UV254、UV365下有藍(lán)色熒光,硫酸顯紫紅色。ESI-MS:m/z647[M+Na]+。UV:210、330。碳譜數(shù)據(jù)見表2。經(jīng)與文獻(xiàn)比較,確定該化合物為β-(3′,4′-dihydroxy-phenyl)-ethylO-α-L-rhamnopyranosyl(1-3)β-D-(4″-O-caffoyl)-glucopyranoside,即洋丁香苷(毛蕊花苷)。與文獻(xiàn)對照,數(shù)據(jù)基本一致?；衔铫?淡黃色無定型粉末,易溶于甲醇和水,不溶于氯仿、丙酮。UV254、UV35下有藍(lán)色熒光。硫酸顯紫紅色。TOF-MS:m/z624[M+]。UV:205、335。碳譜數(shù)據(jù)見表2。推斷該化合物結(jié)構(gòu)為β﹣(3′,4′-dihydroxy-phenyl)-ethyl-O-a-L-rhamnopyranosyl(1-3)β-D-(6″-O-caffoyl)-glucopyranoside,即異洋丁香苷(isoacteoside)。經(jīng)過與文獻(xiàn)對照,數(shù)據(jù)基本一致。化合物Ⅵ-1、2:淡黃色粉末,易溶于甲醇。UV254、UV365下有藍(lán)色熒光,硫酸顯紫紅色。UV:205、330。FAB-MS:m/z527[M+K]+。碳譜數(shù)據(jù)見表2。推斷其結(jié)構(gòu)為肉蓯蓉苷(cistanoside)F(a&b)。經(jīng)過與文獻(xiàn)對照,數(shù)據(jù)基本一致?；衔铫?1、2:淡黃色粉末,易溶于甲醇。UV254、UV365下有藍(lán)色熒光,硫酸顯紫紅色。UVnm:205、220、330。FAB-MS:m/z679[M+K]+。碳譜數(shù)據(jù)見表2。由此推斷該化合物結(jié)構(gòu)為羥基化的洋丁香苷,即凌霄乃苷(campneosideⅡ)(又稱β-hydroxy-acteoside),為一對差向異構(gòu)體。經(jīng)與文獻(xiàn)對照,數(shù)據(jù)基本一致?；衔铫?白色粉末,微溶于甲醇,易溶于DM-SO。UVnm:245、254、263。FAB-MS:m/z1111[M+K]+。碳譜數(shù)據(jù)見表3。經(jīng)過與文獻(xiàn)對照,波譜數(shù)據(jù)與密蒙花苷(mimengoside)A基本一致,故推斷該化合物為mimengosideA?；衔铫?白色晶體,微溶于醇,易溶于DM-SO。UVnm:245、254、263。碳譜數(shù)據(jù)見表3。與文獻(xiàn)報道的密蒙花苷B(mimengosideB),數(shù)據(jù)基本一致,因此該化合物推斷為mimengosideB?；衔铫?白色粉末,易溶于甲醇。UVnm:245、254、263。FAB-MS:m/z:1111[M+K]+。1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)表明該化合物為一個連有4個糖的三萜皂苷類結(jié)構(gòu)。經(jīng)酸水解結(jié)合薄層色譜,與標(biāo)準(zhǔn)糖樣比較,該化合物中含有呋糖、鼠李糖和葡萄糖。碳譜數(shù)據(jù)見表3。經(jīng)過共薄層色譜及液相色譜分析,證實該化合物為準(zhǔn)噶爾鐵線蓮苷A(songarosideA)。波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致。4活動測試4.1體外醛糖還原酶抑制活性篩選醛糖還原酶(AR)是聚醇代謝通路中的關(guān)鍵限速酶。大量動物實驗和臨床研究表明,醛糖還原酶抑制劑(ARI)可以有效改善糖尿病患者聚醇代謝通路異常,從而達(dá)到預(yù)防和延緩糖尿病并發(fā)癥的目的。本試驗以DL-苷油醛為底物、還原型輔酶Ⅱ(NADPHⅡ)為輔酶,37℃下連續(xù)監(jiān)測340nm處反應(yīng)體系吸光度的變化,對中藥密蒙花中的化學(xué)成分和不同的萃取部位、流份進行體外醛糖還原酶抑制活性初步篩選。篩選結(jié)果表明:萃取部位和流份中正丁醇部位活性最強,其次是石油醚部位和大孔樹脂60%乙醇洗脫流份:單體化合物中的異洋丁香苷、密蒙花苷、芹菜素-7-O-蕓香糖苷具有較強醛糖還原酶抑制活性,抑制率均高于陽性對照槲皮素。另外一些單體化合物(如mimengosideB和洋丁香苷)、醋酸乙酯部位和大孔樹脂40%、80%乙醇洗脫流份則具有較弱的醛糖還原酶抑制活性,其余單體化合物抑制率低于10%,認(rèn)為沒有活性。4.2拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的篩選結(jié)果研究表明,中藥密蒙花中的總黃酮和總苯乙醇苷在細(xì)胞水平上有明顯的抗菌(金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌)活性。其中的活性成分為密蒙花苷和洋丁香苷,抗菌最小質(zhì)量濃度為0.86、0.43mg/mL,0.44、0.44mg/mL。另據(jù)報道,從阿拉善馬先蒿中分離得到的洋丁香苷(verbascoside)具有拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑樣作用。為了在分子水平上進一步闡明其藥效和抗菌機制,發(fā)現(xiàn)新的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑,從天然產(chǎn)物中尋找新的抗菌藥物本試驗以拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ為靶點,對中藥密蒙花中的化學(xué)成分(包括單體化合物和提取分離有效部位和流分)進行抗菌活性篩選。測定結(jié)果顯示:石油醚部位(PE-MMH)、醋酸乙酯部位(EtOAc-MMH)、大孔樹脂40%乙醇洗脫部位(40%HP-20)和單體成分芹菜素、異洋丁香苷、密蒙花苷、洋丁香苷以及songarosideA對拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ有較強的抑制作用。在與環(huán)丙沙星(陽性對照)相同質(zhì)量濃度下(1mg/mL),產(chǎn)生類似的抑制效果。5關(guān)于柴胡皂苷及其類化作用從密蒙花中分離得到并鑒定了11個化合物。其中,化合物Ⅲ(芹菜素-7-O-蕓香糖苷),化合物Ⅶ-1、2(cistanosideFa&b),化合物Ⅷ-1、2(campneosideⅡa&b)和化合物Ⅺ(songarosideA)為首次從該種以及該屬(醉魚草屬)中分離得到。得到的皂苷類化合物中,songarosideA具有柴胡皂苷母核。在該屬中分離得到過系列具有柴胡皂苷母核的皂苷類物質(zhì),該類結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定容易發(fā)生變化。比較mimengosideA和songarosideA的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn),后者為前者17位氧環(huán)開環(huán)后的產(chǎn)物。mimengosideA為密蒙花中的原型皂苷,為該種植物中特征性化合物。醛糖還原酶抑制活性篩選實驗結(jié)果表明,密蒙花70%甲醇提取物顯示出醛糖還原酶抑制作用,活性成分為其中含有的黃酮類物質(zhì)(密蒙花苷、木犀