濃鹽法和氨解法提取rna的比較

濃鹽法和氨解法提取rna的比較

0品種及用量對(duì)na合成的影響努倫（核糖酸）是重要的生物遺傳材料，主要分布在物質(zhì)中。這是蛋白質(zhì)合成的指標(biāo)。RNA主要有三大類,其中,核糖體RNA(rRNA)占RNA總數(shù)的80%以上,一般從酵母中提取的大分子RNA主要是rRNA。核酸大分子的不完全水解產(chǎn)物中有核苷和核苷酸。其中鳥(niǎo)苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)是強(qiáng)力助鮮劑,胞苷酸(CMP)和尿苷酸(UMP)可作為生產(chǎn)治療癌癥、肝炎及冠心病等藥物的原料。在化妝品中加入核酸或其水解物,可促進(jìn)皮膚蛋白合成,達(dá)到養(yǎng)護(hù)皮膚的作用。在農(nóng)業(yè)上,RNA降解物具有促進(jìn)作物生長(zhǎng)增產(chǎn)的作用,已在水稻、小麥、柑橘及多種蔬菜中生產(chǎn)應(yīng)用,取得了明顯的增產(chǎn)效果。目前,我國(guó)的核酸工業(yè)雖然取得了一定的進(jìn)展,但同歐美、日本相比仍然比較緩慢。從啤酒酵母中提取RNA的工藝方法很多,本文主要就濃鹽法和氨解法進(jìn)行研究和比較。1材料和方法1.1原材料啤酒酵母,由本系微生物實(shí)驗(yàn)室提供。供試菌種處于對(duì)數(shù)期,此時(shí)含RNA最豐富,約為6%～8%。1.2主試劑食鹽、鹽酸、氨水、乙醇、鉬酸銨、過(guò)氯酸、三氯乙酸、硫酸1.3主要設(shè)備TDL-5離心機(jī)、721分光光度計(jì)、pH計(jì)、電熱恒溫干燥箱、501型超級(jí)恒溫器1.4方法1.4.1不易攪拌的溶液稱取10g供試酵母,配成10%酵母溶液。若濃度太高,溶液成糊狀,不易攪拌;濃度太低,調(diào)上清液等電點(diǎn)時(shí)RNA不易沉淀,因?yàn)镽NA在水溶液中有一定的溶解度。1.4.2雜蛋白凝膠液的制備核酸提取主要分三步進(jìn)行:(1)破壁,使核蛋白從細(xì)胞中溶出。(2)加熱,使雜蛋白變性沉淀。(3)離心,使核酸與蛋白分離,得RNA清液,再調(diào)RNA等電點(diǎn),使RNA粗品沉淀,經(jīng)純化、干燥得到成品。1.4.3脫核酵母菌體分離通過(guò)鹽溶液產(chǎn)生較大的細(xì)胞滲透壓,使細(xì)胞破裂,釋放出核蛋白體,從而使核蛋白體與酵母菌體分離。由于RNA鈉鹽易溶于水,在含鹽的菌體溶液中,RNA有較高的溶解度,這樣,通過(guò)控制溫度使蛋白質(zhì)變性沉淀,通過(guò)離心將RNA及蛋白質(zhì)和脫核酵母菌體分離,從而達(dá)到提取之目的。酵母液→鹽處理→快速加熱→抽提保溫→迅速冷卻→離心分離→上清液→等電點(diǎn)沉淀RNA→乙醇洗滌→干燥→RNA干品1.4.4確定核酸生產(chǎn)電點(diǎn)及其方法,將酸用1.0%氨水處理酵母細(xì)胞,是通過(guò)稀堿作用將酵母細(xì)胞壁中的脂溶性物質(zhì)溶解,使核酸溶出,采取分步調(diào)等電點(diǎn)的方法:加三氯乙酸使蛋白質(zhì)沉淀,同時(shí)用硫酸調(diào)蛋白等電點(diǎn)4.2,除雜蛋白,將核酸上清液用鹽酸調(diào)核酸等電點(diǎn)2.3,離心后得核酸粗品,用70%酒精洗滌得核酸產(chǎn)品。酵母液→氨水破壁→離心分離→上清液→分步調(diào)等電點(diǎn)→乙醇洗滌→干燥→RNA干品1.4.5國(guó)各基因中核酸中nd值的計(jì)算A.上清液中RNA的測(cè)定分光光度法:上清液→調(diào)pH為7→取1mL稀釋500倍→測(cè)OD值→計(jì)算規(guī)定1mg/mL溶液A260=20,則RNA%=A26020×500×1001000%=A26020×500×1001000為100mL溶液中RNA的含量B.RNA干品純度測(cè)試方法精確稱量0.5g粗核酸粉→研磨→加10mL水→5%氨水調(diào)pH為7→50mL容量瓶→冰箱冷置30min→離心分離→取0.5mL定容50mL→測(cè)OD。取兩支10mL離心管,按下式操作:(1)樣品實(shí)際濃度=0.550ml×42×500.5=50ug/ml=0.550ml×42×500.5=50ug/mlRNA%=甲OD260±?乙OD260±0.022×50×100%?0.022RΝA%=甲ΟD260±-乙ΟD260±0.022×50×100%?0.022是濃度為1ug/mL的RNA溶液的OD值甲液OD260為總的核酸,核苷酸的值,乙液OD260為核苷酸小分子的值,兩者之差即為核酸大分子的值。(2),純RNA溶液的A260/A280值為2.0,樣品中若含有蛋白質(zhì),則A260/A280值要下降,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的最大吸收峰在280nm。2結(jié)果與討論2.1循環(huán)使用上清液此方法研究和應(yīng)用最為普遍,本人經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出的最佳工藝條件是:取10%的酵母液,加鹽濃度為10%,加熱溫度為92℃,加熱時(shí)間為4h。一般得率在2.6%左右,純度在74.5左右。由于提取RNA后的上清液中仍含有一定量的RNA,所以采用循環(huán)使用上清液的方法,既省水,又省鹽。下面主要分析一下上清液的循環(huán)使用情況。由上表可知,同樣條件下,使用第二次循環(huán)上清液,即循環(huán)兩次,抽提的RNA的凈得率最高。2.2氨基法提取的鈉2.2.1氨法的破裂條件采用酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%,氨1.0%,破壁溫度為60℃,不同時(shí)間不同量做正交實(shí)驗(yàn)如下:時(shí)間對(duì)提取nat的影響從上表看出,時(shí)間的極差不是最大,即時(shí)間不是最大影響因素,時(shí)間取40min為最佳。最佳配比的確定從上表看出,三氯乙酸的極差也不是最大,即說(shuō)因素B也不是最大因素,三氯乙酸含量取5%為最佳。通過(guò)對(duì)指標(biāo)影響分析得出較好的實(shí)驗(yàn)方案是:A2時(shí)間第二水平40minB3三氯乙酸量第三水平5%考慮經(jīng)濟(jì)因素,三氯乙酸價(jià)格較貴,加2%與5%的量對(duì)RNA得率差別不大,所以通常加2%的沉淀劑。2.2.2提取核酸結(jié)果基于正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,考慮破壁時(shí)間的影響,做補(bǔ)充實(shí)驗(yàn):采用酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%,氨1.0%,在60℃分別破壁30min、40min、50min,加2%三氯乙酸,用H2SO4調(diào)蛋白等電點(diǎn)4.2,離心去雜蛋白,再提取。結(jié)果見(jiàn)表5提取核酸后得上清液,核酸含量測(cè)定如表6:由以上兩表可以看出,破壁50min時(shí)核酸產(chǎn)量最多,上清液中雜質(zhì)多,殘留的核酸液多,可知破壁時(shí)間長(zhǎng),核酸溶出多,同時(shí)其他雜蛋白也較多溶出,從核酸中的百分含量也可以看出50min最好。若破壁時(shí)間短,雖然核酸純度高,上清液中核酸殘留量少,但最終百分含量低,所以不可取;若時(shí)間過(guò)長(zhǎng),其他雜質(zhì)溶出量大于核酸溶出量,影響核酸的等電點(diǎn)提取,所以也不可取,綜上可得,氨解法破壁時(shí)間為50min時(shí)最佳。2.3兩種方法的比較3活性核酸的提取3.1核糖核酸定性定量的測(cè)定采用紫外分光光度法,操作簡(jiǎn)單方便,誤差小。3.