分析方法轉(zhuǎn)移的儀器系統(tǒng)考量與探討

1.分析方法條件一個(gè)有效成功的分析方法轉(zhuǎn)移，首先是方法自身處于可控狀態(tài)，方法有可控的條件與參數(shù)，包括一些操作注意事項(xiàng)。表1是液相色譜方法常見(jiàn)的條件與參數(shù)：表1液相色譜方法常見(jiàn)條件序號(hào)條件（或參數(shù)）1儀器系統(tǒng)2試劑3樣品4對(duì)照品5樣品/對(duì)照品配制6系統(tǒng)適用性溶液配制7方法參數(shù)、包括進(jìn)樣量、檢測(cè)波長(zhǎng)和梯度條件等8進(jìn)樣序列9系統(tǒng)適用性要求10定性或定量計(jì)算方式11樣品溶性穩(wěn)定性情況12注意事項(xiàng)方法轉(zhuǎn)移要考慮的元素有方法程序、樣品配制、化學(xué)試劑、樣品配制、其它的設(shè)備附件、色譜柱、流動(dòng)相，以及色譜儀系統(tǒng)。分析方法操作人員也是一個(gè)關(guān)鍵元素，因?yàn)榉椒ǖ闹R(shí)交流與傳遞非常重要。一個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的分析人員，對(duì)于方法有相當(dāng)?shù)牧私?，哪些地方需要特別注意，哪些地方是方法運(yùn)行的關(guān)鍵。在與接收方實(shí)驗(yàn)人員交流與培訓(xùn)時(shí)，這些經(jīng)驗(yàn)知識(shí)非常重要。方法文件的撰寫(xiě)需要有經(jīng)驗(yàn)的分析人員參與，每一個(gè)關(guān)鍵操作步驟都有詳盡的描述，否則轉(zhuǎn)移后樣品配制的操作方式不同，都有可能導(dǎo)致系統(tǒng)適用性結(jié)果不同。樣品配制用的化學(xué)試劑盡量用同一純度或同一廠家。樣品配制設(shè)備，如pH計(jì)、吸液槍/管、天平等，需要有實(shí)驗(yàn)室可靠的校驗(yàn)方可使用。進(jìn)行方法轉(zhuǎn)移時(shí)需要根據(jù)藥物的研發(fā)階段和方法的需求進(jìn)行適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，如圖1。色譜儀系統(tǒng)、流動(dòng)相、樣品處理和色譜柱是影響方法使用和轉(zhuǎn)移的主要因素。圖1:色譜分析方法風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析元素色譜柱是實(shí)驗(yàn)室間方法轉(zhuǎn)移差異性的關(guān)鍵原因。色譜柱是分析方法的核心元素，它直接影響到系統(tǒng)適用性結(jié)果。方法轉(zhuǎn)移如能?chē)?yán)格要求采用同一廠家同一型號(hào)的色譜柱，可以很大程度減少色譜柱對(duì)于方法的影響。常用的C18?C8等硅烷色譜柱，大廠家大品牌的技術(shù)很成熟，批次與批次間的差異性很小。同一廠家同一型號(hào)的新老色譜柱由于使用時(shí)間不同，柱效會(huì)有差異，這是不同實(shí)驗(yàn)室間柱效不同的主要原因，因此方法轉(zhuǎn)移時(shí)盡量使用新的色譜柱，減少柱效對(duì)方法的影響。在方法轉(zhuǎn)移前，如有色譜柱耐用性的研究考察，將減少方法轉(zhuǎn)移的技術(shù)困難。流動(dòng)相的制備也是方法轉(zhuǎn)移差異性的主要原因。流動(dòng)相組成包括水、有機(jī)溶劑、緩沖鹽或酸堿添加劑。水與有機(jī)溶劑的化學(xué)純度影響色譜圖的基線波動(dòng)與噪音，緩沖鹽與酸堿添加劑的化學(xué)純度是色譜圖中出現(xiàn)鬼峰的主要因素。流動(dòng)相的新鮮制備、pH值的穩(wěn)定性和微生物的濾除會(huì)減少色譜圖中雜質(zhì)峰的出現(xiàn)，從而確保前后色譜圖的一致性。流動(dòng)相的不同制備方式會(huì)導(dǎo)致方法的差異性。比如制備一個(gè)50/50的甲醇/水的混合溶劑有四種方式：①先加入500ml的水至1000ml的容量瓶中，用甲醇稀釋至1000ml;②先加入500ml的甲醇至1000ml的容量瓶中，用水稀釋至1000ml;③分別使用量筒量取500ml的水與甲醇混合；④分別稱量500g的水與甲醇混合。由于水與甲醇混合時(shí)會(huì)有放熱的情況，水與甲醇的密度不同，因此這四種方式制備得到的混合溶劑實(shí)際組成是有一些差別的。這種差別會(huì)導(dǎo)致它作為洗脫劑時(shí)洗脫能力不同，從而導(dǎo)致色譜峰的保留差異。因此在方法文件中要盡可能描述清楚流動(dòng)相的配制過(guò)程、樣品的配制過(guò)程和系統(tǒng)適用性溶液的配制過(guò)程。雙方實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照方法程序的要求進(jìn)行操作，會(huì)減少由于操作本身而導(dǎo)致的差異。流動(dòng)相的配制過(guò)程客觀上會(huì)存在一些差異，因此在方法程序上可以設(shè)計(jì)成色譜系統(tǒng)的多項(xiàng)混合洗脫，使用泵系統(tǒng)進(jìn)行流動(dòng)相混合，減少人工配制導(dǎo)致的比例差異。不同實(shí)驗(yàn)室的色譜儀系統(tǒng)客觀上會(huì)存在一些差異，在方法轉(zhuǎn)移前如能有方法耐用性的研究數(shù)據(jù)支持，或者參考USP<621>通則，適當(dāng)調(diào)整方法參數(shù)，減少這些差別和滿足方法系統(tǒng)適用性的要求。2.色譜儀系統(tǒng)的差別色譜儀系統(tǒng)是方法轉(zhuǎn)移的重要影響因素，也是導(dǎo)致方法不一致的主要原因。色譜儀是由多個(gè)模塊組成，不同模塊有不同型號(hào)，實(shí)驗(yàn)室間的色譜儀器客觀上很難保持完全一致，這種差異會(huì)導(dǎo)致方法轉(zhuǎn)移后的差別。方法的使用壽命有時(shí)也長(zhǎng)于色譜系統(tǒng)，儀器的更新速度也會(huì)增加方法一致性的難度。色譜系統(tǒng)液體流動(dòng)路徑會(huì)影響化合物的保留。這個(gè)路徑包括系統(tǒng)管線、進(jìn)樣器和流動(dòng)相混合器。管線按內(nèi)徑分有0.030’’、0.020’’、0.010’’、0.007’’、0.005’’、0.0025’’等類(lèi)型，一般來(lái)說(shuō)，管線內(nèi)徑的大小對(duì)系統(tǒng)的體積影響不大，但內(nèi)徑不同的管線耐壓能力不同，壓力與流速相關(guān)。所以方法的流速與系統(tǒng)的最大耐壓會(huì)決定選擇哪種管線。進(jìn)樣體積會(huì)影響峰形與分離度。極端的進(jìn)樣體積，如50uL，峰形會(huì)變寬、對(duì)稱性變差，這是因?yàn)闃悠吩诠苈分行暮捅谔幍膶恿魉俣炔煌瑥亩鴮?dǎo)致化合物被擴(kuò)散。色譜的泵系統(tǒng)或者溶劑傳遞系統(tǒng)是方法運(yùn)行的關(guān)鍵因素。常見(jiàn)的有低壓四元混合單泵和高壓二元混合雙泵。等度方法相對(duì)簡(jiǎn)單，受泵的影響較小。梯度方法較為復(fù)雜，流動(dòng)相在系統(tǒng)中的比例受到泵工作原理的直接影響。低壓混合系統(tǒng)中流動(dòng)相各種組分在到達(dá)泵之前就混合完成；高壓混合系統(tǒng)中每種溶劑通過(guò)專門(mén)的泵輸送至混合器中，流動(dòng)相各溶劑比例通過(guò)各泵的相對(duì)流速來(lái)控制。同品牌色譜儀同型號(hào)的泵在不同實(shí)驗(yàn)室間基本可以做到重復(fù)；不同品牌色譜儀，泵的型號(hào)不同，對(duì)于梯度方法轉(zhuǎn)移會(huì)帶來(lái)挑戰(zhàn)。色譜儀延遲體積的大小會(huì)影響色譜峰保留。延遲體積是從流動(dòng)相混合器到柱前入口處的流路體積。延遲體積一般在供應(yīng)商提供的資料中可以查到，也可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試得到，即用兩通代替色譜柱，使用有吸收的物質(zhì)，設(shè)定梯度條件，觀察到的梯度中點(diǎn)與設(shè)置的程序梯度中點(diǎn)，兩間的差值為梯度延遲時(shí)間，乘以流速即為系統(tǒng)的延遲體積。如圖2.圖2:系統(tǒng)延遲體積測(cè)試，梯度程序中兩通代替色譜柱延遲體積受流路內(nèi)徑的影響較小，主要受到色譜儀混合器體積的影響。混合器存在不同體積大小的產(chǎn)品，體積大，梯度的延遲效應(yīng)明顯，復(fù)雜的樣品分離會(huì)影響較大?；旌掀黧w積會(huì)影響系統(tǒng)和色譜柱的平衡時(shí)間，還有方法回到初始梯度的時(shí)間。這些影響在進(jìn)行方法轉(zhuǎn)移時(shí)，實(shí)驗(yàn)分析人員需要考慮。前面提到泵的工作原理，有低壓與高壓混合兩種。在運(yùn)行梯度方法時(shí)，它們的原理是不同的。低壓混合模式是各溶劑通過(guò)比例閥和在線混合器，溶劑按比例混合，然后通過(guò)單泵的高壓傳輸?shù)较到y(tǒng)。高壓混合模式是流動(dòng)相通過(guò)各自的高壓泵，按流速來(lái)控制比例，然后在線混合輸出到管路中。在低壓混合系統(tǒng)中，柱活塞與泵頭之間有一定的空間，使得混合溶劑無(wú)法全體積輸出至管路中，這部分液體將會(huì)對(duì)系統(tǒng)體積的大小產(chǎn)生影響，從而增加梯度的延遲時(shí)間。3.如何保持不同實(shí)驗(yàn)室的色譜儀系統(tǒng)一致性？方法轉(zhuǎn)移的目標(biāo)是要在雙方實(shí)驗(yàn)室得到等效的分析結(jié)果。如前所述，如果不同實(shí)驗(yàn)室色譜儀系統(tǒng)是相同的，理論上結(jié)果應(yīng)是一致的。客觀上不同實(shí)驗(yàn)室間的設(shè)備會(huì)存在差異，比如色譜儀廠家、泵的類(lèi)型、管線大小、進(jìn)樣器、柱溫箱和檢測(cè)器等，還有分析人員的經(jīng)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，都可能存在差異性，從而影響方法轉(zhuǎn)移的等效性結(jié)果。色譜儀溶劑遞送系統(tǒng)是關(guān)鍵的影響因素，它影響著系統(tǒng)的延遲體積，最終會(huì)影響梯度保留時(shí)間。對(duì)于這種影響，有三種解決方式。一是接收實(shí)驗(yàn)室的梯度程序與初始系統(tǒng)的梯度程序準(zhǔn)確地進(jìn)行調(diào)整，使得各峰的保留時(shí)間保持一致。這種方式在實(shí)際操作中比較復(fù)雜的，依賴于方法本身和分析物的復(fù)雜性。也可參考USP<621>通則中的相關(guān)指南進(jìn)行操作，但實(shí)施起來(lái)仍有困難。二是通過(guò)物理性的增加或減少系統(tǒng)延遲體積，以匹配初始系統(tǒng)的延遲體積，如圖3。這種方式的本質(zhì)是增加或減少混合器的體積或數(shù)量，從而調(diào)整系統(tǒng)的體積。該方式比較容易操作與實(shí)現(xiàn)。圖3:改變混合器，調(diào)整系統(tǒng)延遲體積三是調(diào)整進(jìn)樣的時(shí)間程序，從而調(diào)整方法梯度開(kāi)始時(shí)間。通過(guò)在進(jìn)樣程序中設(shè)置進(jìn)樣的時(shí)間，從而達(dá)到梯度開(kāi)始后，進(jìn)樣仍然可以延緩一段時(shí)間后開(kāi)始，該操作類(lèi)同于增加了一部分系統(tǒng)體積，從而增加了保留時(shí)間。如圖4,它是整體增加或減少系統(tǒng)的體積，所以相當(dāng)于整個(gè)延遲或加速方法梯度的間隔。圖4:調(diào)整梯度開(kāi)始時(shí)間以匹配系統(tǒng)延遲體積進(jìn)樣系統(tǒng)在當(dāng)前分析實(shí)驗(yàn)室中基本實(shí)現(xiàn)了全部自動(dòng)化。即由計(jì)算機(jī)程序控制，不同實(shí)驗(yàn)室間的差異很小。不同品牌供應(yīng)商的進(jìn)樣原理可能不同，大部分是定量環(huán)加六通閥，加上洗針程序基本可以消除樣品殘留的影響，所以不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)樣系統(tǒng)對(duì)方法的轉(zhuǎn)移影響較小。柱溫對(duì)于分析方法是一個(gè)重要參數(shù)，柱溫的控制對(duì)方法轉(zhuǎn)移非常重要，它影響色譜峰保留與選擇性。通常同品牌的柱溫控制箱原理是一樣的，不同品牌的柱溫控制箱會(huì)存在差異，它們都有各自的專利保護(hù)。柱溫控制箱主要包括溫度傳感器、加熱元件、隔熱材料、漏液檢測(cè)、空氣循環(huán)、進(jìn)風(fēng)和出風(fēng)系統(tǒng)、溶劑預(yù)熱等組件。這些組成部分，溶劑預(yù)熱會(huì)影響色譜峰的保留與選擇性，如圖5。因此不同品牌的色譜儀，要關(guān)注柱溫箱的控制設(shè)置，盡量保持一致的參數(shù)設(shè)置，減少柱溫對(duì)方法的影響。圖5:方法轉(zhuǎn)移時(shí)的流動(dòng)相預(yù)熱檢測(cè)器也是影響方法轉(zhuǎn)移的一個(gè)因素，商品化常用的紫外檢測(cè)器有單波長(zhǎng)的UV或者全波和的PDA檢測(cè)器。