產(chǎn)纖維素酶熟麥曲菌種的篩選及混合制曲工藝優(yōu)化

產(chǎn)纖維素酶熟麥曲菌種的篩選及混合制曲工藝優(yōu)化

“小麥酒和酒精飲料”是中國黃酒的一個特點，也是中國黃酒生產(chǎn)中的一種傳統(tǒng)操作方法。麥曲作為黃酒釀造的糖化、發(fā)酵和生香劑,其品質(zhì)對曲酒的品質(zhì)和出酒率都有極大的影響,常有“酒之骨”之稱。近幾年,黃酒的生產(chǎn)原料(大多為稻米、黍米、玉米、小麥等)受國內(nèi)和國際糧食市場的影響,黃酒生產(chǎn)的原料成本波動較大,如何提高原料利用率來降低黃酒的生產(chǎn)成本成為黃酒企業(yè)日益突出的問題。黃酒主要釀造原料中除含有豐富的淀粉外,尚含一定比例的粗纖維。這部分成分通常不能被α-淀粉酶、糖化酶直接利用,但在相應(yīng)條件下,可為纖維素酶所分解,并部分轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖,提高出酒率。然而,根據(jù)前期調(diào)查研究,浙江紹興、安徽及上海地區(qū)成品麥曲的CMC酶活為0.02～1.10U/g·干曲之間,普遍很低。纖維素酶(cellulase)是指能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵,使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱。目前,研究較多的能夠降解天然纖維的微生物主要是木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)和曲霉(Aspergillus)等真菌,這類真菌產(chǎn)纖維素酶系較全,能較好地降解天然纖維。本實驗室李旺軍和張波等人通過對紹興黃酒麥曲中微生物群落結(jié)構(gòu)的解析及蛋白質(zhì)組學(xué)研究,已篩選分離到了豐富的原核微生物和真菌資源,并初步確定了麥曲發(fā)酵過程中功能性微生物主要為真菌類。近年來,國內(nèi)有不少采用混合菌株進行固態(tài)發(fā)酵飼料和醬油,以提高產(chǎn)品質(zhì)量或酶活力的研究。本研究以實驗室保藏的108株真菌為出發(fā)菌株,結(jié)合剛果紅平板初篩與制曲復(fù)篩篩選高產(chǎn)纖維素酶的菌株。在傳統(tǒng)熟麥曲的基礎(chǔ)上,將其與米曲霉蘇-16(工廠熟麥曲用菌株)混合、優(yōu)化制曲,提高混合熟麥曲纖維素酶酶活,以期應(yīng)用于黃酒釀造,提高原料利用率,降低黃酒生產(chǎn)成本。1材料和方法1.1實驗用培養(yǎng)基菌種實驗室保藏的浙江古越龍山紹興酒股份有限公司麥曲中分離篩選、保存?zhèn)溆?小麥軋碎3～4瓣,由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供;米曲霉蘇-16由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供;麩皮購于無錫糧油農(nóng)貿(mào)市場;糯米購于無錫大潤發(fā)超市。斜面保藏培養(yǎng)基纖維素剛果紅培養(yǎng)基;酵母膏1.0g、MgS04·7H200.5g、KH2P041.0g、NaCl0.5g、CMC-Na3g、剛果紅0.1g、瓊脂20g、水1000mL、pH自然,0.10MPa下滅菌20min;產(chǎn)孢培養(yǎng)基麩皮∶水=1∶1,pH自然,0.10MPa下滅菌20min。剛果紅(CongoRed)進口分裝Sigma公司;羧甲基纖維素鈉、測定纖維素酶所用試劑國藥集團化學(xué)試劑有限公司;PCR所用試劑大連寶生物工程有限公司。UV-2100型紫外分光光度計UNICO(上海)儀器公司;LHS-150SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。1.2菌株鑒定及實驗優(yōu)化1.2.1纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選用滅菌的一次性牙簽從斜面培養(yǎng)基上挑取少量孢子,點種于纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板上,30℃培養(yǎng)3d后取出,選擇具有透明圈的菌株進行熟曲的制作,步驟如下:1.2.1.1孢子懸液的制備將30℃下培養(yǎng)好的斜面菌種接入裝有15g產(chǎn)孢培養(yǎng)基的三角瓶中。30℃培養(yǎng)4d,然后向三角瓶中加入100mL無菌水,充分搖動,用四層無菌紗布過濾制得孢子懸液,以血球計數(shù)板計數(shù)的方式將孢子濃度調(diào)至107個孢子/mL,4℃保藏備用。1.2.1.2熟麥曲制作工藝參照參考文獻。1.2.2纖維素酶活力的測定參照參考文獻。1.2.3纖維素酶產(chǎn)生菌株鑒定1.2.3.1菌株形態(tài)學(xué)鑒定菌落形態(tài)觀察:在PDA平板上劃線接種,30℃培養(yǎng)4d,取出觀察菌落邊緣和表面的質(zhì)地、顏色等形態(tài);顯微鏡形態(tài)觀察:參考乳酸石炭酸棉藍(lán)染色法,在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子梗及孢子等形態(tài)。1.2.3.2菌株分子學(xué)鑒定采用氯化芐法抽提真菌總基因組DNA,然后,進行PCR擴增ITS序列,將純化后的PCR連接轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌JM-109,挑取陽性克隆子菌液送交上海生工測序部進行測序。獲得的測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行相似性檢索。1.2.4單因素實驗先通過不同菌株的抗性實驗,即在同一平板中,將產(chǎn)纖維素酶較高的菌株與米曲霉蘇-16交叉畫“十”字來觀察菌種之間的抗性。然后將產(chǎn)纖維素酶較高的菌株與米曲霉蘇-16以不同配比關(guān)系制曲,確定用于制備混合熟曲的最佳混合比例,然后依次進行培養(yǎng)時間,含水量和接種量單因子實驗。1.2.5響應(yīng)面實驗優(yōu)化設(shè)計實驗單因素實驗確定中心實驗點后進行多因素交互實驗,采用Box-BehnkenDesign(BBD)優(yōu)化混合熟曲產(chǎn)纖維素酶工藝條件。實驗因素與水平設(shè)計如表1所示。1.2.6小型黃酒釀造實驗浸米:28℃保溫條件下浸米2～3d;蒸飯:待上汽后蒸飯25min左右,保證米飯蒸熟無生心;拌曲:攤涼至室溫,拌曲接種(配方:糯米∶水為1∶1.8,麥曲為糯米量的17%,速釀酒母11.4%);發(fā)酵:30℃主酵3d,每天攪拌2次;15℃后酵12d。1.2.7黃酒中理化指標(biāo)的測定測定發(fā)酵結(jié)束后黃酒的酒精度、總糖、(-氨基氮、總酸等理化指標(biāo)。2結(jié)果與分析2.1不同菌株對熟麥曲產(chǎn)纖維素酶活力的檢測以工廠制備純種熟曲用菌種米曲霉蘇-16為對照,通過剛果紅平板從108株保藏菌種中篩選得到8株能夠產(chǎn)生透明圈的菌株(編號分別為CF1,CF2,CF3,CF4,CF5,CF6,CF7,CF8),將上述菌株分別制作熟麥曲,然后測定纖維素酶活力,重復(fù)3次取平均值,結(jié)果見表2。由上表可知,菌株CF7制成熟麥曲產(chǎn)纖維素酶活力均高于其它菌株,并且是對照菌株米曲霉蘇-16產(chǎn)纖維素酶活力的2.9倍。因此,選擇菌株CF7作為雙菌種混合制曲菌種以進一步實驗研究。2.2sahse-sas-pcr擴增由圖1可以看出,PDA培養(yǎng)基上菌絲初為白色、絨毛狀,菌落中間隆起,向四周輻射稀疏生長;菌落中央菌絲漸變?yōu)辄S灰色,異常厚密;后菌絲變?yōu)榛液谏?產(chǎn)生黑色孢子。光學(xué)顯微鏡形態(tài)顯示,具有曲霉屬典型的頂囊、小梗以及分生孢子。結(jié)合ITS基因序列同源性分析,結(jié)果表明:菌株CF7的ITS序列(圖2)與Aspergillusniger(JN676125)同源性高達99%。因此,初步判定菌株CF7為曲霉屬中的黑曲霉(Aspergillusniger)。2.3單因素流制度的結(jié)果2.3.1不同配比產(chǎn)酶的產(chǎn)酶結(jié)果將篩選得到的菌株CF7與米曲霉蘇-16混合制曲,接種前先將孢子懸液按比例混合并震蕩均勻,每50g蒸熟小麥接種混合好的孢子懸液3.0mL,于30℃、相對濕度為90%～95%條件下培養(yǎng)相同時間。通過測定混合熟曲產(chǎn)纖維素酶的情況,確定用于制曲最優(yōu)的混合比例(見圖3)。可以看出,當(dāng)黑曲霉:米曲霉蘇-16配比為8∶2時,產(chǎn)纖維素酶酶活最高,比單獨培養(yǎng)黑曲霉或米曲霉蘇-16有明顯優(yōu)勢。此外發(fā)現(xiàn),制曲中只要混合有黑曲霉,制成的熟曲纖維素酶酶活均遠(yuǎn)高于米曲霉蘇-16,但除了配比8∶2外,其他配比產(chǎn)酶都弱于單獨培養(yǎng)黑曲霉。這可能原因是黑曲霉與米曲霉蘇-16之間存在一定的相互作用,因為通過十字交叉法(圖4)發(fā)現(xiàn),黑曲霉與米曲霉蘇-16兩株菌交叉區(qū)域,后者比前者長勢略好,表示兩株菌之間有一定抗性。2.3.2不同培養(yǎng)時間對產(chǎn)纖維素酶活性的影響培養(yǎng)溫度為30℃,培養(yǎng)箱相對濕度設(shè)定為90%～95%,接種量為3.0mL,研究培養(yǎng)時間對混合制曲產(chǎn)纖維素酶的影響(見圖5)。由圖5可知,隨著培養(yǎng)時間延長,混合熟曲纖維素酶活性逐漸升高,在48h時達到產(chǎn)酶高峰,比單獨培養(yǎng)黑曲霉提前了4h,隨后延長培養(yǎng)時間,纖維素酶酶活迅速降低。此外,單獨培養(yǎng)米曲霉蘇-16在20h時產(chǎn)纖維素酶為零而混合熟曲產(chǎn)酶已經(jīng)比較可觀了,由此也驗證了黑曲霉與米曲霉蘇-16混合配比是合理的,并且混合培養(yǎng)產(chǎn)纖維素酶比純種培養(yǎng)具有優(yōu)勢。因此,最佳培養(yǎng)時間為48h。2.3.3原料含水量對纖維素酶活性的影響培養(yǎng)溫度為30℃,相對濕度設(shè)定為90%～95%,接種量為3.0mL,培養(yǎng)時間為48h,研究原料含水量對混合制曲產(chǎn)纖維素酶的影響,由于原料小麥蒸熟后本身含水量已經(jīng)達到40%,所以設(shè)置變量范圍為40%～90%。原料含水量對纖維素酶酶活的影響見圖6。由圖6可知,原料含水量對纖維素酶活性影響明顯,當(dāng)含水量低于60%時,纖維素酶酶活逐漸增高,當(dāng)含水量為60%時,纖維素酶達到最大值,之后隨著含水量的增加不斷降低,在含水量達到90%時,纖維素酶酶活急劇降低,這是由于超過霉菌生長最適含水量后,含水量越大,會在原料表面形成水膜,阻礙了空氣與原料的接觸,導(dǎo)致霉菌的生長因供氧不足而受到抑制。因此,選擇原料含水量為60%為最佳條件。2.3.4接種量對纖維素酶活性的影響培養(yǎng)溫度為30℃,相對濕度設(shè)定為90%～95%,培養(yǎng)時間48h,原料含水量為60%,研究接種量對混合制曲產(chǎn)纖維素酶的影響(由于接種量較大,故將其折算入含水量計),接種量對纖維素酶酶活性的影響見圖7。由圖7可知,隨著接種量的增大,纖維素酶酶活不斷增加,當(dāng)接種量為3.5mL時,達到最大值為28.6U/g·干曲;當(dāng)接種量大于3.5mL時,由于菌體生長受到底物營養(yǎng)環(huán)境的制約,以及更多的營養(yǎng)物質(zhì)用于自身生長消耗,故混合熟麥曲產(chǎn)纖維素酶有所下降。因此,實驗較佳接種量為3.5mL(相當(dāng)于7×105個孢子/g原料)。2.4回歸模型的建立與分析由單因素實驗結(jié)果可知,培養(yǎng)時間、含水量和接種量對混合制曲產(chǎn)纖維素酶影響較大,因而按表3進行3因素3水平響應(yīng)面設(shè)計與分析(DesignExpertsoftware7.0.0),實驗結(jié)果見表3?；旌现魄a(chǎn)纖維素酶3D響應(yīng)面如圖8所示。圖8形象直觀地給出了各個因子交互作用的響應(yīng)面和等值線分析圖。由圖可以看出,培養(yǎng)時間、含水量和接種量對纖維素酶活力都有影響,且在所選范圍內(nèi)均存在極值,特別是培養(yǎng)時間與接種量的交互作用影響較大,在響應(yīng)曲面圖中表現(xiàn)為曲面坡度大,變化明顯。從表4可看出,模型的p<0.01,說明模型極顯著;失擬項的p=0.0526,無顯著影響,說明模型擬合較好,無需引入更高次項,模型可行。另外,模型的校正擬合度R2AdjAdj2=99.38%,變異系數(shù)C.V.%=1.16%,信噪比為53.3,表明該模型可以用于解釋實驗設(shè)計及結(jié)果?；旌现魄a(chǎn)纖維素酶對培養(yǎng)時間(A)、含水量(B)和接種量(C)的二次多項回歸方程為:CMC酶=29.08+2.28A+2.81B+1.71C+1.00AB+1.00AC-1.58BC-2.28A2-3.40B2-1.30C2。求得最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時間50.9h、含水量61.8%、接種量3.9mL,預(yù)測纖維素酶的最大酶活力為33.0U/g·干曲。2.5混合制曲產(chǎn)纖維素酶酶活情況為了驗證預(yù)測值,采用上述最優(yōu)培養(yǎng)條件(實際實驗過程中培養(yǎng)時間取51h、含水量取62%、接種量3.9mL)重復(fù)實驗三次,實際測得混合制曲產(chǎn)纖維素酶分別為:32.5、33.1、31.9U/g·干曲,平均為32.5U/g·干曲,是工廠單一菌種熟麥曲產(chǎn)纖維素酶酶活的29.5倍。實際值與預(yù)測值有較好的擬合性,說明該模型可以較好地反映混合制曲產(chǎn)纖維素酶的條件,具有可行性和參考應(yīng)用價值。同時,測定了混合熟麥曲α-淀粉酶酶活平均為29.8U/g·干曲,糖化酶酶活平均為997.4U/g·干曲,酸性蛋白酶酶活平均為477.8U/g·干曲,三種酶酶活力與單一菌種熟麥曲相近。2.6小型黃酒處理2.6.1后酵階段二氧化碳失重圖9顯示了小型黃酒發(fā)酵過程,以添加實驗室自制單一菌種熟曲為實驗對照組。由圖可以看出,主酵期混合熟麥曲黃酒發(fā)酵二氧化碳失重明顯高于對照組,發(fā)酵強勁。進入后酵階段,二氧化碳失重均趨向平穩(wěn),但仍保持一定優(yōu)勢,當(dāng)后酵結(jié)束二氧化碳失重最終達43.69g,比對照組多1.79g。分析原因:混合熟麥曲中纖維素酶將原料中部分纖維素降解為可發(fā)酵性糖;纖維素酶對原料細(xì)胞壁的破壞,釋放出胞內(nèi)淀粉等物質(zhì),協(xié)調(diào)其他酶對原料分子鏈分解,將淀粉質(zhì)原料較多的轉(zhuǎn)化為酵母可利用的糖,促進了酵母的生長。2.6.2提高了酒精產(chǎn)率表5是發(fā)酵結(jié)束后黃酒的幾項主要指標(biāo),可以看出,兩種麥曲釀造的黃酒各項理化指標(biāo)均正常。在相同的發(fā)酵時間內(nèi),混合熟麥曲在一定程度上提高了酒精的產(chǎn)率,相對單一菌種熟曲酒精產(chǎn)率提高了6.1%。另外,發(fā)現(xiàn)混合熟曲發(fā)酵醪液過濾速度遠(yuǎn)快于單一菌種熟曲發(fā)酵醪液過濾速度,這可能是纖維素酶能夠改進淀粉的利用程度和非淀粉碳水化合物的水解,有利于降低發(fā)酵液粘度的緣故。3次多項式數(shù)學(xué)模型的建立及驗證3.1在糧食短缺的今天,提高糧食利用率是企業(yè)生存、適應(yīng)、發(fā)展的根本。本研究持著“取之于曲,用之于曲”的理念,著眼于“提高原料利用率”的目標(biāo),從實驗室保藏的麥曲微生物中篩選到1株產(chǎn)纖維素酶較高的真菌CF7,經(jīng)菌株形態(tài)和ITS基因序列初步鑒定為黑曲霉(A.niger)。3.2在單因素實驗的基礎(chǔ)上,利用實驗設(shè)計軟件Designexpert,采用RSM法建立了優(yōu)化黑曲霉與米曲霉蘇-16混合制曲產(chǎn)纖維素酶工藝條件的二次多項式數(shù)學(xué)模型,研究分析了培養(yǎng)時間、含水量以及接種量對響應(yīng)值的影響。實驗結(jié)果表明:模型擬合程度高,實驗誤差小。當(dāng)黑曲霉與米曲霉蘇-16以8∶2的比例混合接種時,實際實驗最優(yōu)