藏藥當(dāng)佐一測多評法的建立及外標(biāo)法測定當(dāng)佐中4個成分含量的比較

藏藥當(dāng)佐一測多評法的建立及外標(biāo)法測定當(dāng)佐中4個成分含量的比較

傳統(tǒng)藥物成分的復(fù)雜性決定了單成分和指標(biāo)難以客觀評價其質(zhì)量，嚴(yán)重阻礙了藥物現(xiàn)代化的發(fā)展。因此，對某些國家藥物的質(zhì)量評價尤為重要。但是進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量評價,就必須有足夠量、高純度的化學(xué)對照品作保障,然而天然藥物中化學(xué)成分的對照品分離難度大或單體不穩(wěn)定,致使某些對照品供應(yīng)不足且價格昂貴,最終導(dǎo)致多指標(biāo)質(zhì)量控制模式難以應(yīng)用到民族藥物實際質(zhì)量監(jiān)督評價中。針對這一問題,王智民進(jìn)行了“一測多評”(QAMS)的研究,即利用有效化學(xué)成分間內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,只測定1個成分(對照品可得到者),來實現(xiàn)對多個成分(對照品沒有或難以得到者)的同步監(jiān)控,其他一些學(xué)者也相繼提出了類似的分析方法,如:“替代對照品法”。藏藥復(fù)方當(dāng)佐為藏醫(yī)臨床常用傳統(tǒng)制劑之一,由石榴籽、紅花、肉桂、蓽茇、白豆蔻及珍寶藥佐太共6味藥組成,具有溫胃益火、化滯除濕、溫通經(jīng)脈、保肝健胃等的功效,主要用于消化不良、食欲不振、寒性腹瀉、慢性腸胃炎、乙型肝炎、糖尿病等病癥?，F(xiàn)代研究表明,沒食子酸(gallicacid)、羥基紅花黃色素-A(hydroxysaffloryellowA)、桂皮醛(cinnamicaldehyde)、胡椒堿(piperine)分別是單味藥石榴子、紅花、肉桂、蓽茇中的主要藥理活性成分,因此選取這4個成分作為指標(biāo)成分對當(dāng)佐進(jìn)行質(zhì)量控制是合適的。其中胡椒堿對照品比較容易得到。本研究建立了當(dāng)佐的一測多評方法,即只測定其中1個成分(胡椒堿),從而實現(xiàn)多指標(biāo)(沒食子酸、羥基紅花黃色素-A及桂皮醛)的同步監(jiān)測,并對一測多評的技術(shù)適應(yīng)性和應(yīng)用可行性進(jìn)行了探索和評價。1藥品制品檢定所Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng),AgilentChemstation工作站(美國,Agilent公司);Waters高效液相色譜系統(tǒng),Empower工作站(美國,Waters公司);AG135精密天平(瑞士,Mettler-Toledo公司);KQ-2500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);Millipore超純水器(美國,Millipore公司)。對照品沒食子酸(批號:110831-200302)、羥基紅花黃色素-A(批號:111637-200905)、桂皮醛(批號:710-200011)及胡椒堿(批號:0775-200203)均購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇為色譜純(山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠),超純水為Millipore超純水器所制。當(dāng)佐樣品共4批,分別購自于青海省玉樹州藏醫(yī)院(購買日期:2009年11月20日)、四川省甘孜州石渠縣藏醫(yī)院(購買日期:2009年12月15日)、西藏藏醫(yī)學(xué)院藏藥廠(批號080401)、西藏雄巴拉曲神水藏藥廠(批號20090701)。2測定成分的確定:選擇合適的關(guān)鍵因子,建立相對校正因子在一定的線性范圍內(nèi),成分的量(濃度或質(zhì)量)與檢測器響應(yīng)成正比,即:f=W/A(W表示成分的量,A表示響應(yīng)值)。在多指標(biāo)質(zhì)量評價時,以藥材或制劑中某一典型成分(有對照品供應(yīng)者)為內(nèi)參,建立該成分與其他成分間的相對校正因子(RCF),然后通過校正因子計算其他成分含量(m及n代表2個成分)。公式如下:fmn=fm/fn=(Wm×An)/(Wn×Am)31個研究和多評價理論的研究3.1溶液制備3.1.1對照品儲備液的制備精密稱定對照品沒食子酸5.12mg、羥基紅花黃色素-A11.52mg、桂皮醛4.03mg、胡椒堿11.78mg,分別置于4個10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得對照品儲備液。分別精密吸取各對照品儲備液2.5mL,置于10mL量瓶中,然后加甲醇溶解并稀釋至刻度,混勻,制得沒食子酸濃度為0.128mg·mL-1、羥基紅花黃色素-A濃度為0.288mg·mL-1、桂皮醛濃度為0.101mg·mL-1、胡椒堿濃度為0.295mg·mL-1的對照品混合溶液。3.1.2超聲-密封法取樣品1g,精密稱定,置于具塞三角燒瓶中,加甲醇25mL,密封,稱定重量,超聲(功率250W,頻率40kHz)處理30min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足重量,搖勻,濾過,即得。3.1.3陰性樣品溶液參照當(dāng)佐制備工藝,制備分別缺石榴籽、紅花、肉桂及蓽茇的4個陰性樣品,按“3.1.2”項下方法制得陰性樣品溶液。3.2流動相及dad檢測“3.3”項至“3.8”項及“5”項下的試驗均采用Agilent1100色譜系統(tǒng),WatersXTerraRP-C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,以甲醇-水(含0.1%冰醋酸)為流動相,梯度洗脫(0~22.5min,流動相比例5∶95→50∶50;22.5~45min,流動相比例50∶50→88∶12),流速1mL·min-1,DAD檢測器,檢測波長270nm,柱溫25℃,進(jìn)樣量10μL。在上述色譜條件下,各組分分離度良好,以羥基紅花黃色素-A計算理論塔板數(shù)不低于7000。見圖1。1.沒食子酸(gallicacid)2.羥基紅花黃色素-A(hydroxysaffloryellowA)3.桂皮醛(cinnamicaldehyde)4.胡椒堿(piperine)3.3回歸方程的建立精密吸取“3.1.1”項中配制的對照品混合溶液0.1mL,用甲醇依次作等倍比稀釋,配成6個濃度點的系列濃度的溶液,每個濃度點按“3.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定3次,以進(jìn)樣量(μg)對峰面積積分值進(jìn)行回歸處理,得沒食子酸、羥基紅花黃色素-A、桂皮醛、胡椒堿的回歸方程,見表1。3.4測定條件及進(jìn)樣精密吸取“3.1.1”項中配制的對照品混合溶液0.1mL,用甲醇依次作等倍比稀釋,共6個濃度點,每個濃度點按“3.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定3次。以胡椒堿(簡稱P)為內(nèi)標(biāo),計算沒食子酸(簡稱G)、羥基紅花黃色素-A(簡稱H)、桂皮醛(簡稱C)的相對校正因子,見表2。3.5日內(nèi)精密度精密吸取對照品混合溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。結(jié)果沒食子酸、羥基紅花黃色素-A、桂皮醛、胡椒堿的日內(nèi)精密度(RSD)分別為1.4%,0.93%,2.2%,1.4%;精密吸取對照品混合溶液10μL,連續(xù)2d進(jìn)樣,每天進(jìn)樣3次,上述4個成分的日間精密度(RSD)分別為1.5%,1.2%,1.8%,2.4%,表明本方法精密度良好。3.6測定條件精密吸取同一供試品溶液10μL,分別于0,2,6,8,20,48,72h進(jìn)樣,測定。結(jié)果沒食子酸、羥基紅花黃色素-A、桂皮醛、胡椒堿峰面積的RSD分別為1.4%,1.0%,2.4%,2.1%,表明供試品溶液中該4個指標(biāo)成分在3d內(nèi)穩(wěn)定。3.7重復(fù)性試驗結(jié)果將同一廠家的當(dāng)佐樣品,按“3.1.2”項下方法配制成6份供試品溶液,進(jìn)樣測定,結(jié)果沒食子酸(1.61mg·g-1)、羥基紅花黃色素-A(0.90mg·g-1)、桂皮醛(0.11mg·g-1)、胡椒堿(3.00mg·g-1)含量的RSD分別為1.6%,0.97%,1.8%,2.6%,表明該方法的重復(fù)性良好。3.8對照品溶液的制備精密稱取已知含量的樣品(四川石渠縣藏醫(yī)院,2009年12月15日)0.5g共6份,分別精密加入沒食子酸(0.82mg·mL-1)、羥基紅花黃色素-A(0.41mg·mL-1)、桂皮醛(0.07mg·mL-1)及胡椒堿(1.51mg·mL-1)的混合對照品溶液1mL,按“3.1.2”項下方法制備供試溶液,進(jìn)樣測定,結(jié)果見表3。4相對校正因子的重建研究4.1色譜條件對相對校正因子的影響試驗考察了不同高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent1100和Waters)及不同色譜柱[AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6mm×250mm,5μm),WatersXTerraRP-C18(4.6mm×250mm,5μm),ThermoAQUASILC18(4.6mm×250mm,5μm),PhenomenexLunaC18(4.6mm×250mm,5μm),SHIMADZUVP-ODS-C18(4.6mm×250mm,5μm),Kromasil-C18(4.6mm×250mm,5μm)]對相對校正因子的影響,結(jié)果見表4,表明相對校正因子在不同色譜系統(tǒng)和不同品牌色譜柱下具有良好的適應(yīng)性。4.2相對校正因子的確定在2個實驗室對建立的一測多評實驗方法進(jìn)行復(fù)核實驗,同為Agilent1100色譜系統(tǒng)及AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,結(jié)果見表5,說明了相對校正因子在不同實驗室具有良好的可行性。4.3色譜峰相對保留值的計算利用色譜峰相對保留值(內(nèi)參物保留時間與其他成分保留時間比值)定位:由內(nèi)參物的保留時間和色譜峰相對保留值,計算出目標(biāo)峰保留時間,再根據(jù)峰形及光譜吸收變化趨勢,即能夠在一定程度上準(zhǔn)確判斷目標(biāo)峰的位置,結(jié)果見表6,RSD<5%,表明利用相對保留值進(jìn)行色譜峰的定位是可行的。5種方法測得結(jié)果對比分別吸取各批供試品溶液10μL,進(jìn)樣測定。采用一測多評法和常規(guī)外標(biāo)法測定藏藥當(dāng)佐中沒食子酸、羥基紅花黃色素-A、桂皮醛和胡椒堿的含量,結(jié)果見表7。常規(guī)外標(biāo)法測定沒食子酸、羥基紅花黃色素-A、桂皮醛和胡椒堿含量的實測值與一測多評法計算出的計算值,經(jīng)Pearson相關(guān)系數(shù)(r)進(jìn)行比較,分別為0.9999,0.9998,0.9999,1.0000,并經(jīng)t檢驗,P﹥0.05,表明2種方法測得含量無顯著性差異。從表7中可知,不同來源當(dāng)佐樣品中4個指標(biāo)成分含量具有較大的差異,其中四川省石渠縣藏醫(yī)院當(dāng)佐樣品中沒食子酸含量很高,在一定程度上說明藏藥質(zhì)量控制缺乏統(tǒng)一的規(guī)范化。目前,由于民族、宗教、地理及文化等方面的原因,藏藥現(xiàn)代化研究尚處于起步階段,因此民族醫(yī)藥研究者應(yīng)在尊重藏醫(yī)藥傳統(tǒng)的同時,采用現(xiàn)代化醫(yī)藥研究方法對其進(jìn)行客觀公正的研究,促進(jìn)藏醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展,使之更好地服務(wù)于本族群及其他族群患者。6指紋對照峰的確定本實驗先是采用單純的甲醇-水二相,不同的恒濃度比進(jìn)行洗脫,分離效果均很差;接著改用梯度洗脫,分離效果有所好轉(zhuǎn),但仍不理想。通過反復(fù)嘗試,最終采用甲醇-水(含0.1%冰醋酸)系統(tǒng)為流動相,進(jìn)行梯度洗脫(0~22.5min,流動相比例5∶95→50∶50;22.5~45min,流動相比例50∶50→88∶12),在此條件下,當(dāng)佐中沒食子酸、羥基紅花黃色素-A、桂皮醛和胡椒堿4個指標(biāo)成分色譜峰與其他峰達(dá)到基線分離。本研究選用胡椒堿為內(nèi)參物進(jìn)行一測多評是因為胡椒堿為當(dāng)佐中主要藥效成分之一,其對照品廉價易得。在對建立的相對校正因子的評價中,考察了不同色譜柱、不同液相色譜儀及實驗室的影響,RSD均小于5%,說明建立的不同類型化合物之間的校正因子具有較好的可信度;采用一測多評法和外標(biāo)法2種方法對不同來源的樣品進(jìn)行測定,結(jié)果一測多評法與外標(biāo)法得到的含量結(jié)果之間沒有顯著性差異,表明一測多評法可以在對照品