京尼平對抑郁癥模型大鼠海馬內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響

京尼平對抑郁癥模型大鼠海馬內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響

京尼平是傳統(tǒng)中醫(yī)梔子的主要活性成分。京尼平可由梔子苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解得到,可以與初級胺反應(yīng)生成天然的色素應(yīng)用于食品及染料工業(yè)。京尼平的藥理活性主要包括保肝利膽、抗菌消炎、抗血栓形成、抑制脂質(zhì)過氧化以及促進海馬神經(jīng)元再生與修復(fù)等。近年來,京尼平的抗抑郁作用引起了關(guān)注,本課題組前期采用1HNMR方法對大鼠血液和尿液進行代謝組學研究,明確了京尼平的抗抑郁效果,并對其作用機制進行了探討。本研究旨在以被認為與抑郁癥關(guān)系最為密切的腦內(nèi)海馬組織為研究對象,采用代謝組學技術(shù)對其抗抑郁作用機制進一步探討。Duman等認為海馬神經(jīng)元的損傷和功能紊亂是抑郁癥發(fā)病的神經(jīng)生物學基礎(chǔ)之一。慢性應(yīng)激與抑郁癥發(fā)病密切相關(guān),可引起大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元萎縮、變性和死亡。長期處于慢性應(yīng)激狀態(tài)可導致HPA軸功能亢進,引起海馬神經(jīng)元退行性損傷、數(shù)目減少及再生障礙。研究還發(fā)現(xiàn)抑郁癥大鼠海馬中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素等含量顯著降低,單胺氧化酶和乙酰膽堿酯酶活性改變以及抑制性氨基酸(γ-氨基丁酸、甘氨酸)和興奮性氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)含量改變,臨床研究及神經(jīng)成像分析也表明海馬組織參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展。代謝組學是研究機體代謝產(chǎn)物變化的一種新的系統(tǒng)生物學方法,其通過揭示新陳代謝動態(tài)進程中代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律,較全面了解病理變化過程及機體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑,在實驗動物模型評價、病理機制研究及藥物療效評價中展現(xiàn)了其特色和優(yōu)勢。本文在前期實驗的基礎(chǔ)上,采用1HNMR代謝組學技術(shù)探討京尼平對大鼠海馬組織內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響,為進一步闡明京尼平抗抑郁作用機制提供依據(jù)。造模、造模和損害是否被長期給藥藥品、試劑和儀器鹽酸文拉法辛膠囊(成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司,規(guī)格:25mg/粒,批號:090705);D2O(美國默克試劑公司);京尼平(臨川之信生物科技有限公司,規(guī)格:98%,批號:20110505);UP-250超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);Bruker600MHzAvanceIIINMR譜儀(德國布魯克公司);大鼠曠場行為測試箱,自制。動物SPF級成年雄性SD大鼠,體重(200±10)g,北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,動物許可證號SCXK(京)2011-0012。分組及給藥所有大鼠飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境,然后隨機分成空白組(control)、模型組(model)、文拉法辛組(venlafaxine)、京尼平低劑量組(25mg·kg-1)、中劑量組(50mg·kg-1)和高劑量組(100mg·kg-1),每組8只。除空白組外,所有動物前兩周只造模不給藥,后兩周邊造模邊給藥,給藥組分別灌胃相應(yīng)的藥物,空白組和模型組灌胃等量注射用生理鹽水。造模方法模型組及給藥組通過慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(CUMS)程序進行抑郁造模,造模的方法參照文獻,給予的刺激因素包括夾尾5min、禁水24h、禁食24h、電擊足底、陌生物體、4℃冰水游泳5min、束縛應(yīng)激4h、45℃熱刺激5min以及噪音刺激3h。每天給予各組大鼠1種應(yīng)激刺激,持續(xù)4周。體重及糖水偏愛測定造模第0、7、14、21和28天分別測定大鼠體重。糖水偏愛實驗方法參照文獻,造模前一周對大鼠進行1%糖水偏愛訓練(每個鼠籠放置事先定量的兩個水瓶:1瓶純水、1瓶1%糖水)。造模第0、7、14、21和28天分別測定純水和糖水消耗量,以糖水偏愛率(糖水消耗量/總液體消耗量×100%)為評價指標。糖水偏愛訓練和測定均在大鼠禁水24h后進行。曠場實驗曠場實驗于造模第0、14和28天進行,參照文獻,將大鼠放入自制曠場行為測試箱的中心位置,適應(yīng)2min后,觀察4min內(nèi)大鼠的直立次數(shù)、靜止時間和穿格數(shù)。海馬組織的采集實驗第28天,以20%烏拉坦腹腔注射麻醉后,對大鼠海馬解剖,并將海馬組織置于2mL凍存管中,液氮速凍后保存于-80℃冰箱,待分析。海馬組織的1HNMR測定參考文獻方法,稱取海馬組織40mg于1.5mL離心管中,加入含TSP的磷酸鹽緩沖液(D2O配制,pH7.4)700μL,超聲勻漿,以13000r·min-1離心15min,取上清液600μL置于5mm核磁管中,于600MHzNMR儀上進行1HNMR測定。采用弛豫時間編輯(Carr-Purcell-Meiboom-Gill,CPMG)脈沖序列,弛豫延遲320ms,譜寬為8kHz,掃描次數(shù)為64。1HNMR譜圖數(shù)據(jù)處理與分析核磁圖譜采用MestReNova(MestrelabResearch,SantiagodeCom-postella,Spain)處理,以TSP的化學位移為標準對譜圖進行校正并進行相位、基線調(diào)整,參照文獻并結(jié)合ChenomxNMRSuite(ChenomxInc.,Edmonton,AB,Canada)軟件對譜圖中的信號進行歸屬,δ0.5~4.7區(qū)域按δ0.02分段積分,所得積分值歸一化處理,導入SIMCA-P13.0(Umetric,Sweden)軟件進行多元統(tǒng)計分析。R2X、R2Y表示PLS-DA模型的擬合情況,Q2表示模型的可預(yù)測度,它們的大小直接反映模型的可靠程度,其值越大越可靠。統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件處理,以ue0af±s表示,采用單因素方差分析及t檢驗對行為學指標及差異代謝產(chǎn)物進行統(tǒng)計學分析和比較,以P<0.05,P<0.01為差異具有顯著性。結(jié)果1探索和運動能力以及緊張恐懼狀態(tài)體重、糖水偏愛率和曠場行為是CUMS造模的行為學評價指標。體重直接反映了大鼠飲食和消化情況;糖水偏愛率反映動物對獎賞反應(yīng)程度;曠場行為反映大鼠在新異環(huán)境中的探索和運動能力以及緊張恐懼狀態(tài)。本研究中,與空白組相比,模型組大鼠體重增長緩慢、糖水偏愛率低、穿格數(shù)和直立次數(shù)明顯偏少(P<0.05,P<0.01),表明CUMS造模程序引起了大鼠食欲下降、快感缺乏以及運動能力和探索能力下降,模型復(fù)制成功,連續(xù)給予京尼平兩周后,與模型組相比,大鼠體重、糖水偏愛率升高(P<0.05),自主活動及探索行為增強(P<0.05),表明京尼平具有良好的抗抑郁作用。2麻醉劑烏拉坦光譜圖中的代謝成分空白組大鼠海馬組織1HNMR典型譜圖(圖1)主要來源于小分子化合物,圖中δ1.24處的三重峰來自麻醉劑烏拉坦,信號指認及統(tǒng)計分析時均予以排除。譜圖中的信號參照文獻并結(jié)合ChenomxNMRSuite軟件分析,共指認出17種代謝物,主要來源于氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝和能量代謝。其化學位移及譜峰歸屬見表1。3京尼平對大鼠海馬代謝產(chǎn)物的活性影響1HNMR圖譜提供了海馬組織中內(nèi)源性代謝物的基本信息,但直觀分析難以確定各組間的代謝物差異。如果要準確反映各組之間的微小差異,需通過對復(fù)雜數(shù)據(jù)進行降維處理,有效消除多信息共存中重疊部分而提取出主要成分進行分析。采用有監(jiān)督的偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)對各組進行差異分析,結(jié)果見圖2?？瞻捉M和模型組沿t軸明顯分開(R2X:50.7%,R2Y:76.2%,Q2:67.3%),表明大鼠抑郁癥模型復(fù)制成功。各給藥組與模型組沿t軸明顯分開,京尼平低劑量與高劑量有部分重疊,中劑量組與文拉法辛組更為接近,表明京尼平中劑量具有更好的抗抑郁作用。為進一步確定造模前后及藥物干預(yù)后代謝物的變化情況,采用PLS-DA分析對模型組、空白組和各給藥組進行單獨分析,得到PLS-DA得分圖和S-VIPplot圖(圖3)。圖中“S”曲線中每一個點代表1個變量,變量對分類的重要程度由VIP(variableimportanceintheprojection)值的大小來衡量,變量越遠離原點,VIP值越大。根據(jù)VIP值對變量進行篩選,VIP>1作為尋找差異代謝物候選物質(zhì)。通過對空白組和模型組的PLS-DA分析(圖3A),空白組和模型組明顯分開,與行為學結(jié)果一致。對“S”曲線上VIP>1的代謝物峰面積用SPSS軟件進行獨立樣本t檢驗,得到8個具有顯著性差異(P<0.05)的潛在生物標志物,由圖3A和圖4可知,模型組海馬代謝產(chǎn)物中乳酸、谷氨酸、肌醇、丙氨酸、谷氨酰胺和?；撬岷可?而N-乙酰天冬氨酸、甘氨酸含量下降(P<0.05,P<0.01,圖3A)。藥物干預(yù)后(圖3B,C,D,E),與模型組比較,PLS-DA得分圖顯示給藥組與模型組都能明顯分開,與行為學結(jié)果一致,文拉法辛和京尼平均能不同程度地使7種潛在代謝標志物(除?；撬嵬?向正常狀態(tài)回調(diào)(圖4)。文拉法辛組乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺和肌醇含量下降,N-乙酰天冬氨酸和甘氨酸含量升高,均有顯著性差異(P<0.05,圖3B,圖4)。京尼平高、中、低劑量可以使抑郁模型大鼠海馬組織中N-乙酰天冬氨酸、甘氨酸含量升高,肌醇含量降低(P<0.05);中劑量還能顯著調(diào)節(jié)乳酸、丙氨酸和谷氨酸含量,恢復(fù)至正常狀態(tài)(圖3C,D,E,圖4),表明京尼平中劑量具有更好的抗抑郁效果。京尼平對抑郁癥患者多態(tài)性化合物結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用抑郁癥是一種以情緒低落、思維遲緩以及言語動作減少為主要特點的情志障礙性精神疾患,嚴重危害人類身心健康。大量文獻報道海馬與抑郁癥有著密切的關(guān)系,應(yīng)激和抑郁可引起海馬體積萎縮,中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。現(xiàn)有抗抑郁藥通過促進海馬細胞增殖和神經(jīng)元數(shù)目增加、抵抗或克服應(yīng)激誘導的海馬神經(jīng)元萎縮和丟失,實現(xiàn)其神經(jīng)保護作用。文拉法辛是一種選擇性5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)再攝取抑制劑類抗抑郁藥,能增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些神經(jīng)遞質(zhì)的活性。本實驗中,以海馬為研究對象、文拉法辛為陽性對照藥研究京尼平抗抑郁效果及其作用機制。復(fù)制與抑郁癥患者臨床癥狀最為接近的CUMS抑郁模型,行為學結(jié)果表明模型復(fù)制成功。代謝組學研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),海馬組織的N-乙酰天冬氨酸、乳酸、肌醇、?；撬帷⒈彼?、甘氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺受CUMS程序影響較大,具有顯著變化(P<0.05,P<0.01),可能為抑郁癥模型大鼠海馬組織中潛在的生物標志物。給予京尼平后,N-乙酰天冬氨酸、乳酸、丙氨酸、肌醇、甘氨酸和谷氨酸水平不同程度地向正常水平回調(diào),其中以京尼平中劑量的調(diào)節(jié)作用最為顯著。海馬中顯著變化的乳酸和丙氨酸在CUMS模型大鼠血液中也發(fā)現(xiàn)有同樣的變化趨勢。模型組大鼠海馬組織中高濃度的乳酸可能是組織中能量代謝異常導致腦部供能供氧不足而產(chǎn)生,過多的乳酸可引起酸中毒,在腦部加劇細胞毒性腦水腫,對神經(jīng)細胞也具有直接的損傷作用。丙氨酸是一種脂肪族的非極性氨基酸,具有協(xié)助葡萄糖代謝、改善機體能量供應(yīng)的作用。本實驗中乳酸和丙氨酸水平的顯著變化表明抑郁癥的發(fā)生涉及到能量代謝異常。給予京尼平后,丙氨酸和乳酸濃度降低,趨向正常水平,提示京尼平可改善抑郁癥能量代謝異常而發(fā)揮抗抑郁效果。模型大鼠海馬中N-乙酰天冬氨酸水平降低、肌醇水平升高。N-乙酰天冬氨酸不存在于成熟的神經(jīng)膠質(zhì)及血液中,只在神經(jīng)元細胞中才能檢測到,是神經(jīng)元的特有內(nèi)標物,其濃度的下降能夠反映神經(jīng)元的凋亡、功能損害或活性降低。肌醇是一種“生物活素”,參與體內(nèi)的新陳代謝活動,具有免疫、預(yù)防和治療某些疾病等多種作用。在神經(jīng)系統(tǒng)方面,肌醇可作為第二信使影響神經(jīng)遞質(zhì)功能的平衡,而且在維護神經(jīng)膠質(zhì)細胞功能和調(diào)節(jié)突觸活動中起重要作用。N-乙酰天冬氨酸和肌醇的顯著變化表明在模型大鼠海馬組織中神經(jīng)元細胞已經(jīng)受到一定程度的功能或活性的損害,肌醇為了調(diào)節(jié)腦內(nèi)代謝異常以維持平衡而升高。京尼平能有效地回調(diào)N-乙酰天冬氨酸和肌醇,顯示了其具有增強神經(jīng)元活性、保護神經(jīng)膠質(zhì)細胞和促進神經(jīng)元功能的作用。綜上所述,在海馬組織中檢測到的17種代謝物中,甘氨酸、谷氨酸、肌醇、N-乙酰天冬氨酸、乳酸、谷氨酰胺、丙氨酸、牛磺酸為抑郁癥海馬組織中潛在的標志性代謝物。京尼平可不同程度回調(diào)甘氨酸、谷氨酸、肌醇、N-乙酰天冬氨酸、乳酸和丙氨酸水平,其中京尼平中劑量(50mg·kg-1)調(diào)節(jié)作用最為顯著,抗抑郁效果最好。變化的代謝物對能量代謝以及海馬組織神經(jīng)系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮具有重要影響。京尼平可能是通過增強海馬組織中神經(jīng)元的活性、修復(fù)和改善神經(jīng)元的功能、改善抑郁癥組織中能量代謝異常而發(fā)揮作用。代謝組學技術(shù)為藥物作用機制的研究提供了一個良好的平臺,能較為全面地反映生物體藥物干預(yù)作用下的代謝狀態(tài)的變化,并能通過某些代謝物含量的差異推斷藥物的作用機制,具有較好的應(yīng)用前景。神經(jīng)元的損傷或功能障礙是抑郁癥發(fā)生的重要機制之一。抑郁癥患者腦組織中神經(jīng)膠質(zhì)功能受損影響谷氨酸轉(zhuǎn)運