垂直電泳系統(tǒng)工作原理

垂直電泳系統(tǒng)工作原理教案課程名稱分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)授課題目（章、節(jié)）實(shí)驗(yàn)二授課教師陳永燕遲彥授課對(duì)象生物工程031授課時(shí)間8學(xué)時(shí)教學(xué)方法實(shí)際操作（分組實(shí)驗(yàn)）選用教具授課內(nèi)容提要及時(shí)間分配：（8學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)二DNA的檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA紫外風(fēng)光光度計(jì)檢測DNA的濃度和純度[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)[實(shí)驗(yàn)原理]DNA分子在瓊脂糖凝膠中時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下,DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng).具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣,可進(jìn)行分離.凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的DNA,也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同,但構(gòu)型不同的DNA分子。[實(shí)驗(yàn)步驟]1．制備1％的瓊脂糖凝膠溶液；2．封閉有機(jī)玻璃內(nèi)槽，放好梳子，倒膠；3．用移液器將混和了上樣緩沖液的DNA樣品加入點(diǎn)樣孔；4．接通電源電泳；5．觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果[注意事項(xiàng)]1.溴化乙錠是強(qiáng)烈致癌劑，在操作過程中注意戴手套；2.處理稀EB溶液的方法：1）每100ml溶液中加入100mg粉狀活性炭；2）于室溫放置1小時(shí)，不時(shí)攪動(dòng)；3）用Whatman1號(hào)濾紙過濾溶液，濾液可從下水道丟棄；4）用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物予以丟棄。大連大學(xué)教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)及基本要求：掌握瓊脂糖凝膠電泳的分離DNA的原理；制膠流程；制膠注意事項(xiàng)。作業(yè)與思考題：1.瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理?2.影響電泳遷移的主要因素?3.凝膠上樣緩沖液（loadingbuffer）的作用?4.DNA染料EB（ethidiumbromide）的作用?5.瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺分離DNA分子大小范圍?6.DNA純制品，OD260/OD280=？RNA純制品，OD260/OD280=？什么情況下DNA樣品比值偏高或偏低。單元教學(xué)小結(jié)（經(jīng)驗(yàn)效果、問題、改進(jìn)措施、信息反饋等）瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA一：講解相關(guān)知識(shí)：1電泳（electrophoresis)：帶電荷的物質(zhì)，在電場中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳。2瓊脂糖(agarose)：線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取出來的。當(dāng)瓊脂糖溶液加熱到沸點(diǎn)后冷卻凝固形成良好的電泳介質(zhì)。瓊脂糖凝膠可形成三維篩孔的通道。3凝膠濃度決定孔徑大小凝膠濃度越大，形成的孔徑越小，則分辨率越大凝膠濃度越小，形成的孔徑越大，則分辨率越小4實(shí)驗(yàn)原理：DNA瓊脂糖凝膠電泳是分離，鑒定、純化DNA的分子生物學(xué)最常用的技術(shù)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中，向？？移動(dòng)。5影響電泳遷移的主要因素：瓊脂糖濃度DNA的大小DNA的構(gòu)象緩沖液6分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度7不同構(gòu)型質(zhì)粒遷移速率：超螺旋＞線狀＞開環(huán)DNA8緩沖液TAE：乙酸鹽緩沖液TBE：硼酸鹽緩沖液TPE：磷酸鹽緩沖液TAE緩沖液緩沖能力較二者弱；TAE緩沖液在分離分子量較小的DNA分子時(shí)，遷移速率比TBE和TPE快；TAE對(duì)于分子量較大的DNA分子，具有較好的分辨率。TPE凝膠回收DNA片段中含有較高的磷酸鹽，易與DNA形成沉淀，影響酶反應(yīng)。9指示劑：凝膠上樣緩沖液（loadingbuffer）有三種作用：1.增加DNA密度2.便于加樣3.溴酚藍(lán)的遷移速率同300bp的雙鏈DNA分子遷移速率相同。10DNA染料：EB（ethidiumbromide兩個(gè)特性：它可嵌入到核酸分子的堿基中，但不會(huì)和瓊脂糖等介質(zhì)結(jié)合。它可在300nm的波長下發(fā)出熒光。二：講解實(shí)驗(yàn)原理，步驟，注意事項(xiàng)[實(shí)驗(yàn)原理]DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量堿基的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子本身的大小和構(gòu)型，具有不同分子量的DNA片段遷移速度不一樣，遷移速度與DNA分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同分子量的DNA，也可以分離分子量相同、但構(gòu)型不同的DNA分子。一般提取的質(zhì)粒有3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalentlyclosedcircularDNA，簡稱cccDNA)，開環(huán)DNA，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA有一條鏈斷裂，(opencircularDNA，簡稱ocDNA)，線狀質(zhì)粒DNA，即質(zhì)粒DNA在同一處兩條鏈都發(fā)生斷裂(linearDNA，簡稱LDNA)。由于這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同，因此通常抽提的質(zhì)粒在電泳后往往出現(xiàn)3條帶，其中超螺旋質(zhì)粒DNA泳動(dòng)最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。[儀器、材料與試劑](一)儀器1．恒溫培養(yǎng)箱2．瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)3．小型高速離心機(jī)4．高壓滅菌鍋5．紫外核酸檢測儀(二)材料1．pUC18質(zhì)粒(三)試劑1．50xTAE(50倍體積的TAE貯存液)配1000mL50xTAE：Tris242g冰醋酸57mL0.5mol／LEDTA200mLpH8.02．凝膠加樣緩沖液(6x)溴酚藍(lán)0.25％蔗糖40％3．瓊脂糖4．溴化乙錠溶液(EB)0.5μg／mL5．250bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)[實(shí)驗(yàn)步驟](一)制備瓊脂糖凝膠根據(jù)被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量?？蓞⒄障卤恚涵傊悄z濃度％線性DNA的有效分離范圍／kb0.35-600.61-20O.70.8-10O.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3實(shí)驗(yàn)用1.2％瓊脂糖。稱取1.2g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入100mL1xTAE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻即可。(二)膠板的制備1．取干凈的有機(jī)玻璃內(nèi)槽，用透明膠帶將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好(一定封嚴(yán)，不能留縫隙)。2．將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。3．將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面(注意不要形成氣泡)。4．待膠凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明膠帶，然后將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放在電泳槽內(nèi)。注意：DNA樣品孔應(yīng)朝向負(fù)電極一端。5．加電泳緩沖液至電泳槽中，加液量要使液面沒過膠面1-1.5毫米。(三)加樣用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔(記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量)。(四)電泳1．接通電泳槽與電泳儀的電源。DNA的遷移速度與電場強(qiáng)度成正比，一般電場強(qiáng)度不要超過5V／cm。2．當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。(五)染色將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液(在200mL1xTAE緩沖液中加兩滴2mg/mL的溴化乙錠儲(chǔ)存液即可)，在脫色搖床上緩慢搖動(dòng)下染色20-30分鐘。注意：溴化乙錠為致癌物，須戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染環(huán)境。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]在紫外燈(360nm或254nm)下觀察染色后的電泳凝膠。DNA存在處應(yīng)顯出桔紅色熒光條帶(在紫外燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡，以防紫外線對(duì)眼睛的傷害作用)。紫外風(fēng)光光度計(jì)檢測DNA的濃度和純度1基本認(rèn)識(shí):溶液中所有物質(zhì)都有吸收一種波長的光，而讓其他波長的光透過。正象物質(zhì)的熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、密度和溶解度一樣，吸收是物質(zhì)的一種特性。吸收和溶液中物質(zhì)的量相關(guān)，因而它可以被用來測定溶液中物質(zhì)的量。利用物質(zhì)特有的吸收光譜來鑒定物質(zhì)性質(zhì)和含量的技術(shù)，成為分光光度計(jì)技術(shù)。其理論依據(jù)是Lambert定律和Beer定律。靈敏度高，測定速度快，應(yīng)用范圍廣2基本概念1)透光度：設(shè)光線通過溶液前強(qiáng)度為I0，通過溶液后光的強(qiáng)度為It，則It/I0表示透射光的強(qiáng)度是入射光強(qiáng)度的幾分之幾，稱為透光度，transmittance，用T表示。2)吸光度：透射度的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度，Absorbance，用A表示。3)朗伯比爾定律：將朗伯定律與比爾定律合并，得A=abca是常數(shù)，稱為消光系數(shù)；b是光程，cm；c是物質(zhì)的濃度。4)摩爾吸光系數(shù)ε：物質(zhì)的特性常數(shù)，是L=1cm,C=1摩爾/升時(shí)的吸光度。它依賴于通過物質(zhì)的光波波長和物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)吸光度與溶液的濃度和液層的厚度成正比。3分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)1)光源在整個(gè)紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。2)單色器將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。3)樣品室樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4)檢測器利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號(hào)變成可測的電信號(hào)，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5)結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)檢流計(jì)、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行儀器自動(dòng)控制和結(jié)果處理4分光光度計(jì)應(yīng)用1)測定溶液中物質(zhì)的含量--核酸的定量2)可以進(jìn)行物質(zhì)種類的鑒別吸收光譜曲線：用各種波長的單色光分別通過某一濃度的溶液，測定此溶液對(duì)每一種單色光的吸光度，然后以波長為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制吸光度－波長曲線，此曲線即為吸收光譜曲線。各種物質(zhì)有它自己一定的吸收光譜曲線。核酸的定量:兩種方法若樣品較純——分光光度法測定堿基吸收紫外線的量，簡單，準(zhǔn)確。若樣品中DNA或RNA含量較低或含有雜質(zhì)——EB發(fā)出的熒光估測核酸含量。組成核酸分子的堿基，均具有一定的吸收紫外線特征。最大吸收值在波長250-270之間。DNA在260nm波長下，有強(qiáng)吸收。在波長260nm紫外線下，1OD的光密度=50μg/mL（雙鏈DNA）；1OD的光密度=40μg/mL（單鏈DNA，單鏈RNA）；1OD的光密度=33μg/mL（單鏈寡核苷酸）估計(jì)核酸的純度DNA純制品：OD260/OD280=1.8RNA純制品：OD260/OD280=2若DNA樣品中混有蛋白質(zhì)和酚，則比值降低若DNA樣品中含有RNA，則比值增高若DNA樣品中既含蛋白質(zhì)，又含RNA，那么比值也可能為1.8。核酸濃度在1ng/μL以上才能可靠的測量A2605分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)1.樣品的濃度不能過低，或者過高，通常認(rèn)為測定值在吸光度0.1～1.5范圍內(nèi)誤差較?。?.盛液量以2/3為宜，防止溶液濺出。3.混合液不能存在氣泡4.不可用手接觸比色杯光學(xué)面。5.必須使用相同的比色杯測試空白液和樣