煙草k+通道吸收與利用的研究

煙草k+通道吸收與利用的研究

植物吸收k-k的鉀運(yùn)動(dòng)物有關(guān)。鉀運(yùn)動(dòng)物可分為兩類：k通道和高親和力k-轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中k-通道是主要的k吸收通道。K+通道是一種跨膜蛋白,廣泛存在于各種細(xì)胞膜上,它的結(jié)構(gòu)與功能研究是生命科學(xué)交叉領(lǐng)域中研究最活躍的分支之一。K+通道(potassiumchannel)是允許K+特異性通透質(zhì)膜的離子通道,該通道由兩部分組成:一部分是通道區(qū),選擇并允許K+通過;另一部分是門控開關(guān),受環(huán)境中的信號而開關(guān)通道。煙葉K+不僅參與煙葉生理生化反應(yīng)和提高煙株抗逆性,還對煙草的可燃性有明顯作用,與煙葉香吃昧及卷煙制品安全性有密切關(guān)系;但是我國北方煙區(qū)的土壤含鉀量普遍較低,煙葉含鉀量大都不足2%,直接影響到煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。國內(nèi)學(xué)者曾采用施用鉀肥和改進(jìn)栽培方法等措施來提高煙葉含鉀量,但均未得到顯著改善。鉀營養(yǎng)在分子生物學(xué)方面的研究已引起重視。施衛(wèi)明將外源K+通道基因?qū)霟煵?獲得鉀高效利用型轉(zhuǎn)基因煙草株系,研究證明外源K+通道基因的導(dǎo)入不僅可提高肥料鉀和土壤緩效態(tài)鉀的利用率,而且可顯著提高煙葉的含鉀量,使煙草產(chǎn)量和品質(zhì)得到較大幅度的改良;茅野充男等通過分子技術(shù)將擬南芥的K+通道基因轉(zhuǎn)移至煙株中,使其吸鉀能力明顯提高,地上部含鉀量提高18%~22%。因此,可通過現(xiàn)代生物技術(shù)改良煙草鉀營養(yǎng),用基因工程技術(shù)將K+通道和高親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草中,使之高效表達(dá),進(jìn)而提高煙葉含鉀量。1分類標(biāo)準(zhǔn)的類別離子通道中,K+通道是最龐大的家族,根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)可分為不同的類別。從生物學(xué)角度,依據(jù)不同的結(jié)構(gòu)和功能可將K+通道分為三大類:Shaker家族通道、KCO家族通道和其他通道。1.1跨膜區(qū)tms的疏水核Shaker家族通道是K+通道中發(fā)現(xiàn)最早的。Shaker一詞來源于:在乙醚麻醉下缺失該基因的果蠅,自發(fā)強(qiáng)烈地抖動(dòng)其肢體,這種表現(xiàn)型的果蠅取名為Shaker(顫抖)突變子。植物Shaker通道蛋白從N末端至C末端具有6個(gè)跨膜區(qū)(TMS)的疏水核(圖1);第4個(gè)TMS含有作為起電壓感應(yīng)器作用的正電荷氨基酸;第5個(gè)和第6個(gè)TMS之間具有高度保守的離子傳導(dǎo)孔區(qū)(P結(jié)構(gòu)域);C末端區(qū)含有調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域:1個(gè)推測的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS),1個(gè)在大多數(shù)Shaker通道中存在的錨蛋白區(qū)(ANK)和1個(gè)緊靠C末端的富含疏水酸性殘基區(qū)(KHA)。Shaker通道的1個(gè)重要特點(diǎn)是能形成異源四聚體結(jié)構(gòu),允許植物調(diào)節(jié)不同細(xì)胞中的K+轉(zhuǎn)運(yùn)活性,這種調(diào)節(jié)在每個(gè)器官或組織中是獨(dú)立的,并與環(huán)境條件相關(guān)。Shaker家族通道是選擇性的K+通道,在很大程度上受電壓的調(diào)控,按照受激活的電壓范圍及離子流方向不同可細(xì)分為3類:內(nèi)向整流K+通道(K+in)、外向整流K+通道(K+out)和弱內(nèi)向整流K+通道。1.1.1吸收k+流的通道內(nèi)向整流K+通道對K+濃度敏感,依賴電壓,是主要的吸收K+流的通道,如NKT1,KAT1,KAT2,AKT1,AKT2/AKT3,AKT4等,主要存在于細(xì)胞的質(zhì)膜上,在細(xì)胞膜超極化的電壓條件下被激活打開。1.1.2k.m的外部連接外向整流K+通道具有電勢依賴性,可釋放K+流,如NTORK1,GORK,SKOR等。1.1.3k+通道的弱內(nèi)側(cè)濾波1.2kco1基因的拓?fù)洚悩?gòu)KCO通道即鉀通道(K+channel)、鈣激活的(Ca2+activated)和外向整流(outward-rectifying)的縮寫,首次克隆的KCO1基因是通過基因數(shù)據(jù)庫搜索動(dòng)物K+通道新的植物對應(yīng)物時(shí)所鑒定出來的。與動(dòng)物的KCO通道一樣,第1個(gè)得到的擬南芥KCO1K+通道有4個(gè)預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域,兩個(gè)手性結(jié)構(gòu)域在C末端,可能是Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)。植物KCO通道具有手性結(jié)構(gòu)域,這是區(qū)別于哺乳動(dòng)物的顯著特征。KCO家族的拓?fù)洚悩?gòu)結(jié)構(gòu)如圖2。以擬南芥為例,根據(jù)疏水區(qū)組成的不同,KCO通道蛋白可分為兩個(gè)亞家族,即KCO-1P和KCO-2P。1.2.1tms型亞族電壓傳感區(qū)tms和tms型電壓傳感區(qū)景KCO-1P是指由兩個(gè)TMS和1個(gè)P(孔道區(qū)域)組成的亞族。它們的TMS并非用來充當(dāng)電壓感應(yīng)區(qū),核心區(qū)都有1個(gè)高度K+滲透性的特征序列。KCO-1P家族有1個(gè)成員,即KCO3。1.2.2p孔道區(qū)域組成的亞族KCO-2P是指由4個(gè)TMS和兩個(gè)P(孔道區(qū)域)組成的亞族。KCO-2P家族有5個(gè)成員:KCO1,KCO2,KCO4,KCO5和KCO6。1.3孔區(qū)及c的鈣調(diào)素結(jié)合域和環(huán)核苷酸結(jié)合域環(huán)核苷酸門控通道(CNGC)是作為膜上的非選擇性配體陽離子門控通道,植物CNGC結(jié)構(gòu)具有6個(gè)跨膜區(qū)(S1~S6)、S5和S6之間的孔區(qū)及C端的鈣調(diào)素結(jié)合域(calmodulinbindingdomain,CaMBD)和環(huán)核苷酸結(jié)合域(cyclicnucleotidebindingdomain,CNBD),其結(jié)構(gòu)與Shaker家族基因相似。KAB1是從擬南芥EST中分離出來的一種能夠?qū)haker通道活化的蛋白,KAB1跟動(dòng)物的β亞基一樣,能夠跟Shakerα亞基一起表達(dá)來活化沒有活性的Shaker通道。2k-通道的克隆、表示分析和功能2.1k+通道基因akt1的擴(kuò)增Shaker通道基因的首次克隆是L.Jan通過觀察果蠅突變子的表型而得到的。1992年Sentenac等人首次在植物上克隆到K+通道基因AKT1;同年,Anderson等亦從擬南芥中克隆出鉀通道基因KAT1。2.1.1篩選同源克隆Shaker通道基因中,擬南芥的研究最全面。擬南芥Shaker家族由9個(gè)成員組成:KAT1,KAT2,AKT1,AKT2/AKT3,AKT5,AKT6,AtKC1,SKOR,GORK。這些基因是通過酵母突變體功能互補(bǔ)、cDNA文庫篩選的方法得到的。目前從煙草中克隆的Shaker通道基因有NKC1、NpKT1、NKT1、NTORK1、NKT2和NtKC1,其中NpKT1基因的克隆是1999年在日本煙草公司植物育種和遺傳實(shí)驗(yàn)室完成,但文章尚未公開。1)酵母功能互補(bǔ)策略克隆酵母功能互補(bǔ)策略是指具有某種營養(yǎng)缺陷型的突變株在缺少該營養(yǎng)的培養(yǎng)基上不能生長,但若把互補(bǔ)該功能的外源cDNA或表達(dá)型cDNA文庫轉(zhuǎn)化到該突變株中,即可恢復(fù)該突變株的生長,這樣就可以克隆到新的cDNA。AKT1和KAT1就是采用來自擬南芥各種組織的cDNA文庫,通過缺乏K+運(yùn)輸體的酵母突變體功能互補(bǔ)的方法克隆得到的。2)同源克隆同源克隆是指根據(jù)其它已知的氨基酸保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因中間片段,然后利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)和染色體步移技術(shù)分別得到全長cDNA和全長基因。2004年ToshioSano采用同源克隆法得到煙草K+通道基因,有NKT1,NTORK1,NKT2和NtKC1,均屬于Shaker通道,2008年郭兆奎等采用同源克隆法獲得了黃花煙草K+通道基因NKC1。目前模式植物擬南芥基因組全序列測定已經(jīng)完成,大量基因的功能也被揭示出來,這為煙草K+通道基因的同源克隆提供了豐富的資源。3)cDNA文庫篩選的克隆cDNA文庫篩選是指用已知基因設(shè)計(jì)探針從基因文庫中釣取新的目的基因的方法。煙草K+通道基因的克隆可以用已知基因序列作為探針,從煙草各組織的cDNA文庫中克隆K+通道。在擬南芥中,AKT2是以AKT1為探針、從擬南芥cDNA文庫篩選出的K+通道基因,KAT2是以KAT1為探針、從擬南芥cDNA文庫中篩選出KAT2等功能類似的K+通道基因。AKT3是從擬南芥文庫中,采用以K+通道(TMTTVGYGD)標(biāo)記的寡核苷酸去分離K+通道基因。AtKC1(KAT3)(AKT4)是利用AKT1為探針,利用DNA分子雜交從擬南芥中分離出來。因此,煙草K+通道基因的克隆可以設(shè)計(jì)探針,從煙草各組織的cDNA文庫中克隆K+通道。2.1.2非洲生理結(jié)構(gòu)的變化煙草K+通道的表達(dá)分析可采用Northernblot分析和熒光定量PCR分析,功能分析可采用酵母雙雜交、Western-blot、雙向電泳等方法。Northernblot分析表明,AKT1主要在根中表達(dá),特別是在成熟根表皮、皮層和內(nèi)皮層,AKT1編碼的蛋白運(yùn)輸K+在轉(zhuǎn)移互補(bǔ)酵母到無鉀介質(zhì)的試驗(yàn)中證實(shí)。KAT1編碼一個(gè)能夠被超極化激活的K+通道蛋白,表達(dá)具有組織特異性,主要表達(dá)部位是保衛(wèi)細(xì)胞,在根和莖維管組織中也有少量表達(dá),KAT1的功能從非洲爪蟾屬光滑卵母細(xì)胞上的表達(dá)得到證實(shí)。KAT1以低親和力K+吸收方式進(jìn)入保衛(wèi)細(xì)胞,在氣孔開合中扮演重要角色,并向維管組織轉(zhuǎn)運(yùn)K+,而非直接從土壤中吸收K+。AtKC1(KAT3)(AKT4)作為Shaker家族,卻不具有K+通道作用,但可通過調(diào)節(jié)AKT1,來中斷K+流進(jìn)入根毛細(xì)胞。一旦被吸收,K+分泌進(jìn)入根木質(zhì)部以及傳遞到地上部便涉及到SKOR(StelarK+outwardrectifyingchannel)通道,SKOR在根中柱鞘、木質(zhì)部軟組織、花粉中表達(dá),當(dāng)膜去極化時(shí)SKOR被激活,該通道可調(diào)節(jié)木質(zhì)部汁液中50%的K+外流.AKT3主要在韌皮組織表達(dá)。用卵母細(xì)胞中的異源表達(dá)和電壓鉗分別研究其生理學(xué)功能和電特性,發(fā)現(xiàn)它只受膜電勢的微弱調(diào)節(jié),可能參與了韌皮部裝載和卸載中的K+運(yùn)輸。通過RNA凝膠分析和PCR技術(shù),鑒定出AKT2和AKT3在源和庫的韌皮組織中均有存在,它們是同一基因編碼的兩個(gè)蛋白質(zhì),在爪蟾卵母細(xì)胞中具有相同功能。植物脅迫激素ABA能增加AKT2轉(zhuǎn)錄的數(shù)量,顯示AKT2對于干旱可能有某些反應(yīng)。K+通道在擬南芥的根、莖、葉、花中均有表達(dá),因此依據(jù)擬南芥及其它作物K+通道的表達(dá)部位,可以在煙草相應(yīng)的部位克隆出相應(yīng)的K+通道基因。2.2kco通道2.2.1煙草kco通道基因1997年Czempinski等從擬南芥中成功克隆到首個(gè)KCO1基因。KCO1是以Shaker通道的P結(jié)構(gòu)域的保守序列為探針,從擬南芥的EST數(shù)據(jù)庫中篩選出來的。目前煙草還沒有該基因的報(bào)告,但可利用EST文庫篩選、同源克隆和cDNA文庫篩選等方法得到煙草KCO通道基因。KCO1,KCO2和KCO6特點(diǎn)是各自通道蛋白的C末端具有1~2個(gè)EF手形,EF區(qū)域參與Ca2+調(diào)節(jié)AtTPK1通道的過程。KCO4缺少EF手形。KCO5顯示為弱的EF手形。最近研究表明,該家族的有些成員,如KCO4,并不具備外向整流K+通道的功能,所以,該家族又被命名為TPK(Tandem-PoreK+)通道。KCO4(At-TPK4)是在質(zhì)膜上發(fā)揮功能的,它可能在花粉管生長過程中參與K+平衡及膜電位的調(diào)節(jié)。2.3正確篩選大米鈣調(diào)素結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白植物CNGC離子通道是Schuurink等人在1998年篩選大麥鈣調(diào)素結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白時(shí)首次確認(rèn)的。KAB1是Tang等應(yīng)用EST從擬南芥的cDNA文庫中分離到編碼K+通道β亞基的基因。2.3.2功能1:金屬酶原位雜交植物CNGC主要定位在細(xì)胞膜上,能夠?qū)⑼饨缧盘栟D(zhuǎn)變成跨膜的陽離子流。它的功能主要是作為信號傳導(dǎo),對離子轉(zhuǎn)運(yùn)、生長發(fā)育、抗逆性等起作用。原位雜交實(shí)驗(yàn)表明,KAB1在葉細(xì)胞(尤其是保衛(wèi)細(xì)胞)中表達(dá)較高,在根細(xì)胞中表達(dá)較低。Western雜交表明,在葉、花、根細(xì)胞的胞質(zhì)區(qū)和膜區(qū)都存在KAB1。3k+吸收的酶動(dòng)力學(xué)植物K+吸收機(jī)制研究最早由Epstein等人開展,他們采用酶動(dòng)力學(xué)方法來描述K+吸收,并把K+吸收分為2個(gè)機(jī)制。另外,目前還有一種觀點(diǎn),就是共存的鉀吸收機(jī)制。3.1逆k+吸收動(dòng)力學(xué)方程K+吸收機(jī)制I指高親和力K+吸收,K+吸收服從Michaeli-Menten動(dòng)力學(xué)方程,在低外界K+濃度(如大麥在外界0.001~0.2mmol/L)下起作用。高親和力K+吸收為主動(dòng)吸收機(jī)制,因?yàn)镵+吸收是逆K+電化學(xué)勢梯度,可能與K:H或K:Na的協(xié)同運(yùn)輸相關(guān)。高親和力K+吸收機(jī)制的作用是受誘導(dǎo)性表達(dá)的。3.2煙草k+吸收機(jī)制研究K+吸收機(jī)制Ⅱ指低親和力K+吸收,在高的外部K+濃度(如大麥在外界1~10mmol/L)下起作用。低親和力K+吸收為經(jīng)由K+選擇性通道的被動(dòng)運(yùn)輸。低親和力K+吸收機(jī)制的作用是組成性表達(dá)的。楊鐵釗等在以NC89為材料的煙草研究中得出的結(jié)論也與Epstein相一致。煙草鉀積累量隨外界離子濃度提高呈現(xiàn)快速—緩慢—快速—緩慢的交替變化,顯示出煙草K+吸收機(jī)制也是兩個(gè)吸收機(jī)制的特性。兩個(gè)吸收機(jī)制的特性以不同煙草基因型為基礎(chǔ)。魯黎明等研究表明,不同煙草基因型的K+親和力及吸收能力是影響烤煙鉀營養(yǎng)效率高低的重要因素;牛佩蘭等研究結(jié)果顯示,煙草基因型間的吸鉀能力、鉀利用效率及葉片含鉀量存在顯著差異,并且這種差異可以穩(wěn)定遺傳。3.3多個(gè)k+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)共存的鉀吸收機(jī)制是指機(jī)制I和機(jī)制Ⅱ共同作用來吸收K+。K+通道和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體共同轉(zhuǎn)運(yùn)K+:在擬南芥中,K+選擇性通道AKT1和AtKC1、高親和力K+轉(zhuǎn)運(yùn)體AtKUP4在根外層細(xì)胞的質(zhì)膜上執(zhí)行K+吸收;AtKUP1、AtKUP2和AtHKT1轉(zhuǎn)運(yùn)體也可能對根K+吸收有貢獻(xiàn)。劉貫山等認(rèn)為:在植物中存在多個(gè)K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,原因如下:1)植物不同器官或組織的營養(yǎng)和能量需求不同;2)養(yǎng)分的轉(zhuǎn)運(yùn)跨不同的膜(質(zhì)膜、液泡膜、質(zhì)體內(nèi)外膜等),因而需要不同的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制;3)根細(xì)胞外環(huán)境條件、養(yǎng)分和有毒競爭離子濃度變化很大。組成型和誘導(dǎo)型高親和力吸收組份對變化的養(yǎng)分有效性和離子條件反應(yīng)不同;4)基本養(yǎng)分積累機(jī)制的冗余對于植物生存可能是重要的。由此可見,植物通過根系從土壤中吸收K+以及K+在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)需要許多不同的膜蛋白,植物具有多個(gè)K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制?？傊?煙草的K+吸收機(jī)制是以煙草的基因型為基礎(chǔ)的。當(dāng)外界K+濃度低時(shí),高親和力K+吸收起主要作用;當(dāng)外部K+濃度高時(shí),低親和力K+吸收起主要作用。并且這兩種吸收機(jī)制是共存的,在實(shí)際生產(chǎn)中煙草所吸收的K+主要以低親和吸收為主。4k-通道分子調(diào)節(jié)的技術(shù)手段目前主要有兩種技術(shù)進(jìn)行K+通道分子調(diào)控的研究,一是采用電壓鉗,二是采用巨大膜片鉗等技術(shù)來揭示K+通道的內(nèi)流和外流。4.1離子電流的檢測電壓鉗可以測量細(xì)胞的膜電位、膜電流和突觸后電位。電壓鉗是向細(xì)胞內(nèi)插入一根微電極往胞內(nèi)補(bǔ)充電流,補(bǔ)充的電流量正好等于跨膜流出的反向離子流量,這樣就能控制膜電位數(shù)值不變。經(jīng)過離子通道的離子流與經(jīng)微電極施加的電流方向相反,數(shù)量相等,故可定量測定細(xì)胞變化時(shí)的離子電流。武維華使用膜片鉗技術(shù),揭示擬南芥根細(xì)胞K+通道AKT1的活性受由LKS1基因編碼的蛋白激酶CIPK23的正向調(diào)控。過量表達(dá)LKS1基因可使植物在低K+條件下的K+吸收速率增強(qiáng),顯著提高植株對低鉀脅迫的耐受性。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),CIPK23促進(jìn)植物K+吸收是通過對細(xì)胞K+通道AKT1的磷酸化來實(shí)現(xiàn)的,而CIPK23的上游受兩種鈣信號感受器CBL1和CBL9的正向調(diào)控。植物根細(xì)胞K+通道AKT1是植物細(xì)胞自土壤溶液中吸收鉀的主要執(zhí)行者。在擬南芥植物中過量表達(dá)LKS1、CBL1/9基因以增強(qiáng)AKT1的活性,能顯著提高植株對低鉀脅迫的耐受性。4.2k+通道對流轉(zhuǎn)換分子偶聯(lián)機(jī)制膜片鉗技術(shù)是研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”,應(yīng)用該技術(shù)可以證實(shí)細(xì)胞膜上離子通道的存在,通過記錄細(xì)胞膜片上的離子通道電流來反映通道分子的生理特性,進(jìn)而對各種生理機(jī)制進(jìn)行深入細(xì)致的研究。李樂攻等利用大膜片鉗、電壓鉗、DNA改組(DNAShuffling)等技術(shù),發(fā)現(xiàn)了控制K+通道流向轉(zhuǎn)換的分子偶聯(lián)機(jī)制,揭開了使同一離子通道的離子流向發(fā)生逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵因素。他首先進(jìn)行DNA改組,將擬南芥基因在分子水平上進(jìn)行有性重組,然后得到的產(chǎn)物分別植入CY162篩選系統(tǒng)(該酵母沒有內(nèi)向型K+通道)。再用電生理學(xué)方法分析篩選,后來發(fā)現(xiàn)實(shí)際上只要312和271兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基偶聯(lián)改變,通道流向就會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變。該定點(diǎn)改變實(shí)驗(yàn)證實(shí)了通道流向轉(zhuǎn)換的分子偶聯(lián)機(jī)制。這項(xiàng)研究成果不僅發(fā)現(xiàn)了控制植物K+流向的新機(jī)制,也為其他離子的流向控制提供了可供借鑒的調(diào)控模式。因此在煙草方面可采用以上兩種技術(shù),再結(jié)合生物技術(shù)尋找K+通道的上游調(diào)控元件,或通過改變K+通道氨基酸點(diǎn)與點(diǎn)之間的殘基來揭示K+流向。5k+通道基因的構(gòu)建煙草雖然是模式植物,但對于其本身的K+通道研究很少,所以可圍繞煙草的K+吸收機(jī)制,重點(diǎn)研究煙草的K+通道的調(diào)控。第一,在基礎(chǔ)研究方面,可更深一步地揭示K+轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制;第二,在煙草應(yīng)用方面,把分子水平的生理功能跟目前的栽培技術(shù)結(jié)合起來,可提高鉀肥利用率,緩解我國鉀肥貧瘠現(xiàn)狀。在生產(chǎn)應(yīng)用上,采用可能提高鉀含量的基因構(gòu)建基因構(gòu)件,使其能調(diào)控?zé)熑~的基因表達(dá);再經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定分離,通過改善細(xì)胞代謝環(huán)境,調(diào)控細(xì)胞離子通道系統(tǒng),篩選高鉀含量煙草。采用上述方法,能顯著提高煙葉的鉀含量,如擴(kuò)大篩選規(guī)模,可獲得含鉀量更高的煙葉。另外,采用轉(zhuǎn)基因的方法導(dǎo)入K+通道基因,可提高煙草