木豆葉總芪對(duì)高脂模型兔脂質(zhì)代謝的影響

木豆葉總芪對(duì)高脂模型兔脂質(zhì)代謝的影響

根據(jù)大量研究，高血壓是中風(fēng)、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病和猝死的危險(xiǎn)因素。降脂治療可逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生,顯著降低心血管疾病所致的死亡和相關(guān)事件。從藥用植物中尋找具有降脂作用的天然產(chǎn)物,成為近年來的研究熱點(diǎn)。木豆(CajanuscajanL.)生長在我國南部的多個(gè)省份,屬于木豆科木豆屬,為多年生常綠灌木。本實(shí)驗(yàn)前期的研究首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)木豆葉總芪可以降低高脂模型小鼠血脂水平和肝臟脂質(zhì)蓄積。在研究高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制以及調(diào)脂藥和抗動(dòng)脈硬化藥物時(shí),建立典型的動(dòng)物模型十分重要,非嚙齒類動(dòng)物兔在建立高脂血癥模型中最為常用,被推薦為有關(guān)調(diào)血脂藥和抗動(dòng)脈粥樣硬化藥研究的主要?jiǎng)游?。所以本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)復(fù)制高脂血癥兔模型,首次觀察木豆葉總芪(TSC)對(duì)高脂模型兔脂質(zhì)的影響。細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流可以減少細(xì)胞膽固醇的蓄積,從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生和進(jìn)展。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)子A1(ATP-BindingCassetteTransporterA1,ABCA1)所介導(dǎo)的膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverecholesteroltransport,RCT)是膽固醇外流的初始步驟,其在RCT過程中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察TSC對(duì)RCT和ABCA1蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討了TSC降脂作用的可能機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動(dòng)物飼養(yǎng)動(dòng)物顯示普通級(jí)健康純種雄性新西蘭白兔36只,3月齡,體質(zhì)量(2.21±0.22)kg,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所(合格證號(hào)0160214),分籠飼養(yǎng),飲水不限;THP-1細(xì)胞來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心,為人來源的單核白血病細(xì)胞系。1.1.2木豆葉總治療木豆葉采自廣西省,鑒定人為林雨霖教授,標(biāo)本保存地點(diǎn)為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。木豆葉總芪由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所化學(xué)室斯建勇教授提供。將木豆葉經(jīng)乙醇回流提取3次,依次以乙烷和二氯甲烷萃取,結(jié)晶析出后過濾得木豆葉總芪。主要含有木豆素、木豆素C和木豆素A3種芪類化合物,質(zhì)量比為4∶1∶0.26;血脂康(北京北大維信生物科技有限公司)。1.1.3抗人abca1和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗菌體的檢測總膽固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensitylipoproteincholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(highdensitylipoproteincholesterol,HDL-C)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);[3H]膽固醇(GE公司);PMA和apoA1(Sigma公司);小鼠抗人ABCA1抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠抗體(IgG)(SantaCruz公司);小鼠抗人β-actin抗體(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)。1.2方法1.2.1量情況隨機(jī)分組所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,穩(wěn)定后記錄體質(zhì)量并進(jìn)行基線血脂測定,根據(jù)血清TC水平和體質(zhì)量情況隨機(jī)分為6組,即空白對(duì)照組(control)、高脂模型組(model)、血脂康組(Xuezhikang)、木豆葉總芪高劑量組(TH)、木豆葉總芪中劑量組(TM)和木豆葉總芪低劑量組(TL),每組6只。各組之間血清TC和體質(zhì)量水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。1.2.2普通飼料及造模采用喂食高脂飼料的方法建立兔高脂模型?？瞻讓?duì)照組每日給予普通飼料,其余各組每日每只給予高脂飼料120～150g(豬油10%,蛋黃粉7.5%,膽固醇1%,普通飼料81.5%),造模時(shí)間14d。1.2.3給藥劑量及給藥方式高脂2周后測血脂水平,觀察高脂模型建立成功后,繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)并開始灌胃給藥。木豆葉總芪高、中、低劑量組分別給予200、100和50mg/kg,血脂康組給予0.12g/kg。每天1次,共24d。每周稱體質(zhì)量1次,以調(diào)整給藥劑量。所有藥物均以30%乙醇作為溶劑制作藥物混懸液?？瞻讓?duì)照組和高脂模型組以等量溶劑灌胃。1.2.4肝臟生化指標(biāo)的測定實(shí)驗(yàn)開始前及以后的2、6周,空腹禁食12h(不禁水)后于清晨從耳緣靜脈取血2mL,分離血清,置-20℃冰箱保存。按試劑盒說明測定TC、TG、HDL-C及LDL-C水平。第6周末,耳緣靜脈注入空氣法處死全部動(dòng)物,摘取各組動(dòng)物肝臟,0.9%氯化鈉注射液洗凈,吸干并稱濕重,液氮速凍后-80℃保存。配置Folch液(氯仿∶甲醇為2∶1),采用Folch法提取各組兔肝臟中的脂質(zhì)并測定。1.2.5肝臟組織的準(zhǔn)備和觀察取肝臟正中葉相同部位的組織,4%多聚甲醛固定,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)及病理學(xué)改變。1.2.6細(xì)胞培養(yǎng)模式THP-1細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(含青霉素100U/mL,鏈霉素100U/mL),在細(xì)胞培養(yǎng)箱中以37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng),每2～3d換液。1.2.7血清rpmi1340將佛波酯(PMA)存儲(chǔ)液加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,使PMA終濃度為100ng/mL。用此培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48h,誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。1.2.8細(xì)胞培養(yǎng)及檢測膽固醇流出分析按文獻(xiàn)描述的方法進(jìn)行,THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA(100ng/mL)誘導(dǎo)48h后分化為巨噬細(xì)胞,加入含有7.4×103Bq/mL[3H]膽固醇的10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基共孵育48h。棄去上清,PBS清洗細(xì)胞3次,細(xì)胞分為對(duì)照組、C03高劑量組(CH,3×10-5mol/L)、C03中劑量組(CM,3×10-6mol/L)、C03低劑量組(CL,3×10-7mol/L)和雌二醇組(E2,1×10-7mol/L),分別加入含有不同濃度C03或E2的含2mg/mL牛血清白蛋白的無血清RPMI1640培養(yǎng)基,正常組加入與E2等體積的無血清RPMI1640培養(yǎng)基。24h后棄去每孔中液體,PBS重復(fù)洗2次,加入含有apoA-I(10μg/mL)的無血清RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)作用12h。用閃爍計(jì)數(shù)法測定上清和細(xì)胞內(nèi)[3H]膽固醇,記為每分鐘脈沖數(shù)(CPM)。膽固醇流出率(%)=(上清液CPM值/上清液CPM值+細(xì)胞裂解液的CPM值)×100%。1.2.9sds-東南角電泳膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS清洗3次,在無酶細(xì)胞消化液冰浴消化10min后輕柔刮取收集細(xì)胞,細(xì)胞超聲粉碎后,14000r/min離心15min,收集細(xì)胞膜蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白含量,取等量蛋白(25μg)進(jìn)行SDS電泳,電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜,5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1h,一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h,TBST洗膜后以ECL發(fā)光試劑盒顯影并曝光。1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(—x±s)(x—±s)表示,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均輸入SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,所有結(jié)果采用(ONE-WAYANOVA)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。2結(jié)果2.1肝臟濕重的變化模型組兔肝臟干濕重均顯著高于對(duì)照組(P<0.01);相比模型組,TSC和血脂康組兔肝臟濕重并無下降趨勢。各組均取濕重1g的肝臟,烘干后稱干重,TH、血脂康和TM干預(yù)后肝臟干重均較模型組明顯降低(P<0.01和P<0.05),且TSC組肝臟干重隨劑量增加而下降,顯示TSC可明顯降低高脂血癥兔的肝臟干重(表1)。2.2tsc和血脂康干預(yù)前后肝臟血脂指標(biāo)比較高脂模型組兔肝臟中TC和TG含量顯著高于對(duì)照組(P<0.01),表明高脂飲食可以升高動(dòng)物的肝臟脂質(zhì)水平。TSC和血脂康干預(yù)后肝臟內(nèi)脂質(zhì)含量均較模型組明顯降低,TSC組的肝臟TC和TG水平隨用藥劑量的增加而下降。TH組兔肝臟中TC和TG含量與模型組相比,分別降低了36.0%和38.0%(均P<0.01),表明木豆葉總芪提取物可以抑制肝臟脂質(zhì)的蓄積(表2)。2.3木豆葉總細(xì)化對(duì)小鼠血清tc和tg水平的影響實(shí)驗(yàn)前各組間血脂無明顯差異;實(shí)驗(yàn)2、6周模型組的TC、TG水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01),表明高脂模型建立成功;給藥后,TSC各組、血脂康組與模型組相比,血脂水平均有一定下降,且TSC組的血清TC和TG水平隨用藥劑量的增加而下降。與模型組相比,TH組的TC和TG顯著降低,分別減少了35.4%和12.3%(P<0.01和P<0.05),顯示木豆葉總芪200mg/kg可明顯降低異常升高的血清TC和TG。模型組的血清LDL-C水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01),而TH、血脂康組和TM、TL組的LDL-C水平顯著低于模型組(P<0.01和P<0.01),其中TH、TM、TL組的LDL-C含量比模型組各自下降了29.1%、7.9%和7.7%,表明木豆葉總芪具有明顯降低血清LDL-C的作用(P<0.01)(表3)。2.4木豆葉總治療肝臟病理的組織病理學(xué)觀察肉眼觀察對(duì)照組兔肝臟為鮮紅色,邊緣銳利,表面光滑,切面無顆粒感;其他各組動(dòng)物肝臟形態(tài)變化相似,體積均明顯增大,包膜緊張,質(zhì)地油膩。高脂模型組肝臟顏色呈暗黃色,木豆葉總芪高劑量組肝臟顏色較模型組淺,但比對(duì)照組深。光鏡下觀察:(1)對(duì)照組:肝小葉完整,輪廓清晰,肝細(xì)胞呈條索狀排列,核圓規(guī)整,細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀,匯管區(qū)基本結(jié)構(gòu)清晰可見(圖1A)。(2)高脂模型組:肝細(xì)胞腫脹,細(xì)胞排列紊亂,充滿大小不等的脂肪空泡,空泡大者可將肝細(xì)胞核推向一側(cè),含脂肪的肝細(xì)胞可破裂或融合成脂肪囊腫(圖1B)。(3)木豆葉總芪高、中及低劑量組:與模型組肝細(xì)胞相比腫脹程度減輕,脂肪空泡少。且隨用藥劑量增加,肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積改善越明顯(圖1C,D,E)。(4)血脂康組:與模型組相比,肝細(xì)胞腫脹程度明顯好轉(zhuǎn),脂肪空泡減少(圖1F)。2.5醇上傳率測定C03與THP-1細(xì)胞共同孵育24h后,可以增加THP-1細(xì)胞[3H]膽固醇流出率,且該作用同樣具有劑量依賴性。與對(duì)照組比較,C03高劑量組細(xì)胞[3H]膽固醇流出率增加了55.39%(P<0.01),表明C03能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的膽固醇代謝,增加膽固醇由巨噬細(xì)胞內(nèi)向外流出,減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積(表4)。2.6木豆葉總針c03對(duì)tp-1mcclovac細(xì)胞apa1蛋白的形成有影響3不同途徑木豆葉總治療肝臟功能血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平與動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生呈明顯負(fù)相關(guān),HDL-C拮抗AS的最主要機(jī)制在于參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)過程。RCT促進(jìn)外周組織和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟進(jìn)行代謝,降低血漿膽固醇水平,減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積,進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展。在RCT過程中,ABCA1是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)中高脂飼料喂養(yǎng)后兔血脂水平顯著升高,表明高脂模型建立成功。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,木豆葉總芪可以顯著降低高脂模型兔血清和肝臟TC、TG水平及血清LDL-C水平;另外,觀察到木豆葉總芪對(duì)肝臟濕重的降低作用不明顯,卻對(duì)肝臟干重降低作用明顯,推測可能與肝細(xì)胞存在不同程度的細(xì)胞腫脹和水樣變性有關(guān),同時(shí)提示木豆葉總芪可以降低肝臟質(zhì)量。病理結(jié)果提示木豆葉總芪各組肝細(xì)胞脂肪變性情況明顯好轉(zhuǎn),且隨用藥劑量的增加,肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積改善越明顯,表明木豆葉總芪對(duì)高脂模型兔脂質(zhì)代謝紊亂有良好的改善作用;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示木豆葉總芪單體成分C03可劑量依賴性上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流,降低血脂及肝臟脂質(zhì)水平。通過上述結(jié)果可知,木豆葉總芪對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)的高脂血癥兔脂質(zhì)有降低作用,其降脂機(jī)制可能是通過增強(qiáng)細(xì)胞ABCA1表達(dá),促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流,啟動(dòng)RCT過程有關(guān)。木豆葉總芪能夠改善體內(nèi)紊亂的脂質(zhì)代謝,并具有治療動(dòng)脈粥樣硬化和脂肪肝等疾病的潛在作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討木豆葉總芪影響膽固醇代謝的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。各組THP-1巨噬細(xì)胞在給予不同濃度C03和E2作用24h