靈芝液體發(fā)酵多糖三萜

摘要靈芝是我們中國(guó)從古至今一直在延用的一種名貴中藥材，具有很高的藥用價(jià)值，其中含有的多糖和三萜是真菌重要的活性物質(zhì)。采用Plackett-Burman法分析不同碳源對(duì)靈芝多糖以及三萜合成的影響。以不同時(shí)期靈芝發(fā)酵液的提取產(chǎn)物作為研究材料，測(cè)定發(fā)酵液中所含有的靈芝多糖含量和三萜含量，并利用Plackett-Burman法分析不同時(shí)期的多糖含量，評(píng)價(jià)多糖含量與不同碳源的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基添加果糖、乳糖，麥芽糖碳源組對(duì)靈芝胞外多糖的產(chǎn)量影響最大；果糖、乳糖，麥芽糖碳源組對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量的影響最大；葡萄糖，蔗糖碳源組合對(duì)靈芝生物量的產(chǎn)量影響最大；蔗糖，麥芽糖碳源組合對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量影響最大。本研究可為靈芝發(fā)酵提高重要參考。關(guān)鍵詞：靈芝；液體發(fā)酵；多糖；三萜；Plackett-BurmanAbstractGanodermalucidumisarareChinesemedicinalmaterialthathasbeenusedinChinasinceancienttimes.Ithashighmedicinalvalue.Thepolysaccharidesandtriterpenescontainedinitarethetwoimportantactivesubstancesofthisfungus.TheeffectsofdifferentcarbonsourcesonthesynthesisofGanodermalucidumpolysaccharidesandtriterpeneswereanalyzedbyPlackett-Burmanmethod.ThepolysaccharidecontentandtriterpenecontentinG.lucidumfermentationbrothweredeterminedbyusingtheproductextractedfromG.lucidumfermentationbrothindifferentperiods,andthepolysaccharidecontentindifferentperiodswasanalyzedbyPlackett-Burmanmethod,andthecorrelationbetweenpolysaccharidecontentanddifferentcarbonsourceswasevaluated.ThisstudycanprovidesomereferencedataandconclusionsfortheefficientapplicationofG.lucidumandthehighqualityresearchanddevelopmentofhealthcareproducts.Theresultsshowedthattheeffectoffructose,lactoseandmaltoseontheextracellularpolysaccharideofG.lucidumwasthegreatest.Fructose,lactoseandmaltosehadthegreatestinfluenceonthecontentofG.lucidumtriterpenes.ThecombinationofglucoseandsucrosehadthegreatesteffectonthebiomassofGanodermalucidum.ThecombinationofsucroseandmaltosehadthegreatesteffectontheintracellularpolysaccharideofG.lucidum.Keywords：Ganodermalucidum;Polysaccharide;triterpenoids;liquidfermentation;Plackett-Burmanmethod目錄1.引言 11.1.靈芝的概述 11.1.1.靈芝簡(jiǎn)介 11.1.2.靈芝的主要成分 11.2.靈芝多糖簡(jiǎn)介 11.2.1.靈芝多糖的功能活性 21.3.靈芝三萜簡(jiǎn)介 31.3.1.靈芝三萜的功能 31.4.靈芝多糖提取 41.5.靈芝三萜提取 41.6.外源物質(zhì)對(duì)靈芝三萜合成的影響 51.7.課題的研究背景與內(nèi)容 52．材料與方法 62.1.材料、藥品及儀器 62.1.1.菌種 62.1.2.試劑 62.1.3.基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分 62.2.主要儀器 72.3.方法 72.3.1.Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 72.3.2.菌種活化 82.3.3.液體種子制備 82.3.4.液體發(fā)酵 82.3.5.生物量測(cè)定 82.3.6.多糖測(cè)定 92.3.7.菌絲三萜含量測(cè)定 93.結(jié)果與分析 93.1.Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 93.2.Plackett-Burman分析不同碳源對(duì)靈芝多糖合成的影響 103.3.Plackett-Burman分析不同碳源對(duì)靈芝三萜合成的影響 113.4.Plackett-Burman分析不同碳源對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖合成的影響 124．小結(jié)與討論 12致謝 13參考文獻(xiàn) 13PAGE15Plackett-Burman分析不同碳源對(duì)靈芝多糖以及三萜合成的影響1．引言1.1.靈芝的概述1.1.1.靈芝簡(jiǎn)介靈芝（Ganodermalucidum），別名紅芝、木靈芝，是一種多孔蓖科真菌靈芝的子實(shí)體，植物本身呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的漆感光澤,外貌主要的特征是當(dāng)其菌蓋孔口外表濕潤(rùn)時(shí)會(huì)呈現(xiàn)鮮美色澤，顏色豐厚飽滿。多孔靈芝生長(zhǎng)在中國(guó)東亞暖溫帶和亞熱帶的地區(qū),全國(guó)各省都曾有研究發(fā)現(xiàn)靈芝的繁殖和生長(zhǎng)[1]。靈芝在中醫(yī)學(xué)中有著重要的地位，是我國(guó)歷史有名的藥材之一。靈芝擁有很多對(duì)人體調(diào)節(jié)和保持健康的好處，尤其是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)上,對(duì)各種腫瘤的擴(kuò)大和擴(kuò)散都有一定的抑制作用[2,3]。甚至Ganodermalucidum還可用作在臨床治療患者時(shí)，起到消炎、止痛、止血和補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)等效果[4]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期科學(xué)研究和臨床治療，能從靈芝里分離出的成分包括三萜、多糖、蛋白質(zhì)及生物堿[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)多糖有調(diào)節(jié)免疫[8]，控制血糖，治療潰瘍，抑制氧化，延緩衰老，防止腫瘤等藥用價(jià)值和臨床意義。1.1.2.靈芝的主要成分靈芝含有蛋白質(zhì)、氨基酸、甾醇、三萜類化合物、多糖和生物堿等多種重要活性成分[9]。我們將一層一層的面紗揭下，看到內(nèi)部的成分，并更加準(zhǔn)確地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)生活。劉松照[10]等學(xué)者的結(jié)果表明，利用靈芝子實(shí)體中的三萜類化合物提取得出了：3種靈芝醇、2種靈芝烯醇和l6種靈芝酸等多種三萜類成分。靈芝多糖也是學(xué)者們爭(zhēng)相研究的活性物質(zhì)，多糖在臨床治療中也廣受關(guān)注。1.2.靈芝多糖簡(jiǎn)介我們可以在靈芝的菌絲體、子實(shí)體，發(fā)酵液中分離提取出各種類型的靈芝多糖[11]。多糖里主要是β–葡聚糖，小部分是α–葡聚糖，靈芝多糖主要含有以下單糖:D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖，L-巖藻糖等。以螺旋纏繞的方式將三股單糖鏈繞成多糖鏈，其3D結(jié)構(gòu)與脫氧核糖核酸相似，在空間結(jié)構(gòu)層中以氫鍵連接而成。此外，對(duì)靈芝的研究，不論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外，都不乏有專家學(xué)者研究靈芝多糖的生物化學(xué)性質(zhì)，且越來(lái)越多的結(jié)果表明了，靈芝多糖具有顯著的生產(chǎn)價(jià)值和臨床治療的意義。1.2.1.靈芝多糖的功能活性（1）抗氧化作用近幾年來(lái)，越來(lái)越多的人注重養(yǎng)生，而養(yǎng)生最主要的就是延緩身體衰老程度，人體的衰老，主要依靠人體中自由基的含量來(lái)決定。有學(xué)者應(yīng)用激光共聚焦方法，測(cè)定靈芝多糖對(duì)小鼠腹部存在的巨噬細(xì)胞里的氧自由基含量，明顯觀測(cè)到靈芝多糖擁有顯著且有效的抗自由基能力[12]。（2）抗腫瘤作用生態(tài)環(huán)境被破壞得越來(lái)越嚴(yán)重，優(yōu)質(zhì)水資源的缺乏，空氣治療下降，被污染的土壤，人們生存環(huán)境遭到不可逆破壞，而且人們?cè)陔娮赢a(chǎn)品的簇?fù)硐?，作息生活?xí)慣嚴(yán)重混亂，導(dǎo)致健康無(wú)法得到良好地調(diào)節(jié)，人體免疫機(jī)制不能夠有效地戰(zhàn)勝癌細(xì)胞，導(dǎo)致癌細(xì)胞在體內(nèi)瘋狂地增值，從而形成癌癥，運(yùn)用破碎靈芝孢子粉可以使各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到最佳效果，研究證明，靈芝孢子粉能夠控制住肺癌荷瘤小鼠腫瘤進(jìn)一步擴(kuò)大[13]。（3）降血糖糖尿病患者在進(jìn)食過(guò)量的糖食時(shí)，機(jī)體的激素調(diào)節(jié)跟不上節(jié)奏，或胰島素不能與受體正常的結(jié)合，則會(huì)造成糖尿病及血糖含量超出正常范圍值的結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)中證明，靈芝多糖可以通過(guò)提高胰島素與受體蛋白的結(jié)合速度，改善胰島素的分泌情況，改善病情[14]。（4）調(diào)節(jié)免疫功能中醫(yī)和西醫(yī)最大的不同在于，中醫(yī)是提高自身免疫能力或恢復(fù)自身機(jī)能進(jìn)而對(duì)抗疾病；西醫(yī)是用藥物的特性直接攻擊病毒細(xì)胞，或用藥物對(duì)抗外在因素來(lái)維持身體各激素的分泌。李風(fēng)華[15]等學(xué)者，環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)雛雞的免疫抑制的試驗(yàn)中，觀察到注射靈芝多糖后能夠維護(hù)雛雞的免疫抑制作用，為免疫細(xì)胞存活增殖，所以靈芝這一中藥材對(duì)提高免疫力有顯著作用。（5）抗疲勞現(xiàn)代很多人群出現(xiàn)亞健康狀態(tài)，年紀(jì)輕輕就出現(xiàn)很多意想不到的疾病。在研究中發(fā)現(xiàn)，靈芝制劑能夠降低血清中TC、TG、FFA水平，從而具有緩解疲勞和恢復(fù)體力的作用[16]，疲勞得到緩解才能更加高效地投入工作和生活中去。1.3.靈芝三萜簡(jiǎn)介靈芝具有豐富的化學(xué)物質(zhì)，在靈芝中提取出大約有150種三萜化合物質(zhì)[17]。何為三萜？三萜是由6個(gè)“異戊二烯”組合而成的化合物，其化學(xué)式為（C5H8）6。作為總稱叫做靈芝三萜，而四環(huán)三萜和五環(huán)三萜是靈芝孢子粉中能夠消滅癌細(xì)胞作用的化合物，所有靈芝三萜并非都能夠有效地抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。現(xiàn)在醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)可以快速有效地檢測(cè)出癌細(xì)胞，癌癥患者也慢慢走進(jìn)我們的生活中來(lái)，在癌癥的早期或者中期被治愈的幾率都是很大的，但大部分人是在身體嚴(yán)重不適后才去檢查，確診后可能已經(jīng)是中晚期或更嚴(yán)重的情況，這種情況，多數(shù)人是采用介入手術(shù)加上靶向藥物或者中藥一同治療，而中藥里，靈芝孢子粉就是很好的選擇。1.3.1.靈芝三萜的功能（1）保肝護(hù)肝肝病患者很難有效地利用肝臟進(jìn)行解毒，增加了肝臟負(fù)擔(dān)，如果不加以干預(yù)治療，極大可能會(huì)患上肝癌。王洪慶[18]等學(xué)者將靈芝三萜應(yīng)用于人體肝臟，測(cè)肝細(xì)胞成活率，觀察到肝臟細(xì)胞成活率增大，進(jìn)一步證明靈芝三萜對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。（2）抗癌功效最近國(guó)內(nèi)外，部分學(xué)者的研究均證明靈芝三萜是一類顯著得防癌細(xì)胞物質(zhì)，靈芝三萜運(yùn)用細(xì)胞毒效果來(lái)對(duì)抗腫瘤生長(zhǎng)[19]。靈芝三萜的提取物用于上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)(EMT)，以及用于原癌基因(c-myc)的調(diào)控，以此來(lái)防止前列腺癌。報(bào)道還表明，靈芝有阻止5-a還原酶的活性作用，阻止雄激素產(chǎn)生受體活性，降低癌變幾率[20]。（3）改善睡眠睡眠是人類調(diào)節(jié)身體激素分泌和緩解疲勞的重要生物活動(dòng)，當(dāng)人到老年，睡眠質(zhì)量會(huì)有所下降，造成失眠和睡眠時(shí)長(zhǎng)下降得結(jié)果，導(dǎo)致人體機(jī)能得不到有效地調(diào)節(jié)，生物鐘混亂后，就容易出現(xiàn)一些不可預(yù)料地疾病。在有關(guān)于優(yōu)化小白鼠睡眠質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)里，發(fā)現(xiàn)靈芝三萜酸有增加睡覺質(zhì)量和延長(zhǎng)睡眠時(shí)間的作用，從而得出，靈芝三萜酸具有優(yōu)化睡眠的功能[21]。（4）抗菌、抗病毒王開金等[22]探究了靈芝提取物GLTs的相關(guān)作用，從恥垢分枝桿菌的增殖曲線，以及GImU基因的表達(dá)，包括細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化的研究里，發(fā)現(xiàn)靈芝提取物GLTs對(duì)M.S-155病毒的抑制具有明顯的作用。1.4.靈芝多糖提?。?）水溶提取法楊曉梅等[23],在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用水溶提取法來(lái)提取靈芝子實(shí)體中的多糖成分。實(shí)驗(yàn)步驟：eq\o\ac(○,1)稱量，eq\o\ac(○,2)加料液，eq\o\ac(○,3)熱水浸提，eq\o\ac(○,4)過(guò)濾，eq\o\ac(○,5)熱水浸提，eq\o\ac(○,6)過(guò)濾，eq\o\ac(○,7)醇析，eq\o\ac(○,8)離心，eq\o\ac(○,9)取沉淀，eq\o\ac(○,10)除游離蛋白，eq\o\ac(○,11)離心取上層液。再利用苯酚-硫酸法來(lái)檢測(cè)靈芝粗多糖溶液中西藏野生靈芝子實(shí)體粗多糖含量。該方法相較于其他多糖提取法來(lái)說(shuō)，在靈芝多糖的提取率上處于一個(gè)中等水平。此方法可以運(yùn)用于野生靈芝的馴化工作。（2）超聲波提取法超聲波的使用，可使得物質(zhì)強(qiáng)烈震蕩搖擺，劇烈的空化反應(yīng)和高效的混合效果，讓分子和物質(zhì)加快運(yùn)動(dòng)，類似于催化反應(yīng)一般，縮短物質(zhì)之間反應(yīng)所需要的時(shí)間，有效地使各個(gè)成分與溶劑混合均勻，從而增加多糖的提取效率[24]。（3）酶法酶法能有效地提取藥物成分，并起到顯著作用，找到適宜的酶以利用，助于降解細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)之間的纖維素、半纖維素，細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)毀掉后，降低物質(zhì)結(jié)合的外力，加大成分產(chǎn)出。（4）微波輔助法微波萃取法在國(guó)內(nèi)受到大量運(yùn)用，常見在中醫(yī)藥學(xué)里，用于提取藥物中有效物質(zhì)，有助于實(shí)驗(yàn)中對(duì)多糖的提取，能對(duì)多糖生物活性成分高的物質(zhì)進(jìn)行篩選，較少實(shí)驗(yàn)資源的浪費(fèi)，縮短實(shí)驗(yàn)工序。（5）高壓熱水提取法主要原理是使用高壓將細(xì)胞破碎,使得多糖從細(xì)胞中流出,高壓熱水提取法便于操作，工序簡(jiǎn)單。1.5.靈芝三萜提?。?）超聲波輔助法康同輝等[25]實(shí)驗(yàn)證明，超聲波輔助法，有利于乙醇提取靈芝三萜。（2）靈芝三萜優(yōu)等提取條件[26]浸提溫度，浸提時(shí)間對(duì)靈芝三萜提取率的影響較為顯著。最佳提取工藝參數(shù):18倍的乙醇用量,提取溫度在60°,提取的最優(yōu)時(shí)間為2h，Ph值是8.5。1.6.外源物質(zhì)對(duì)靈芝三萜合成的影響適量地加入一些外源物質(zhì)可以有效地提高靈芝三萜地產(chǎn)出率。趙艷等[27]研究證明,使用一些中藥材可以提高靈芝三萜提取率，比如加入相對(duì)含量的金銀花、枸杞子或者連翹水提物和醇提物有助于靈芝三的產(chǎn)出率的提高,相反金銀花和銀杏的水提物和醇提物對(duì)三萜的產(chǎn)出率有所降低。趙小瑞等[28]證明,黃芪、甘草、黨參、當(dāng)歸能夠激發(fā)三萜的產(chǎn)出率。1.7.課題的研究背景與內(nèi)容背景在于：栽培法生產(chǎn)靈芝具有明顯的缺點(diǎn)，如栽培周期長(zhǎng)、占地面積大、目前，靈芝主要通過(guò)人工栽培的方法進(jìn)行生產(chǎn)，獲得其子實(shí)體。靈芝子實(shí)體可直接作為中藥材，或以此為原料產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定以及不易工業(yè)化生產(chǎn)。近年來(lái)，液體深層發(fā)酵法由于其周期短、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，且可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因此靈芝液體深層發(fā)酵法開始廣泛應(yīng)用于靈芝生產(chǎn)，以菌絲體、多糖以及三萜為主要目標(biāo)產(chǎn)物。內(nèi)容有：以不同時(shí)期靈芝發(fā)酵液的提取產(chǎn)物作為研究材料，測(cè)定發(fā)酵液中所含有的靈芝多糖含量和三萜含量，并利用PB法分析不同時(shí)期的多糖含量，評(píng)價(jià)多糖含量與不同碳源的相關(guān)性。獲得對(duì)靈芝多糖、三萜產(chǎn)量，生物量有利的碳源，對(duì)進(jìn)一步開發(fā)利用和提高經(jīng)濟(jì)效益提供參考。意義在于：碳源是大型真菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵的重要營(yíng)養(yǎng),對(duì)其生長(zhǎng)代謝及其發(fā)酵產(chǎn)物的形成有直接的影響，探索不同碳源對(duì)靈芝菌絲量、靈芝多糖含量及三萜產(chǎn)量的影響,對(duì)推動(dòng)靈芝發(fā)酵高效生產(chǎn)，有重要作用和積極意義,為靈芝代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持實(shí)驗(yàn)依據(jù)。采用液體發(fā)酵靈芝菌絲體，形成的產(chǎn)物不僅含有靈芝多糖,還有大量次生代謝產(chǎn)物,利用液體發(fā)酵代替栽培法，是一種潛在的新途徑。中國(guó)已經(jīng)是世界第二大經(jīng)濟(jì)體，人民的生活水平和質(zhì)量也在日益提升，年輕人為了實(shí)現(xiàn)自己的人生價(jià)值，愿意來(lái)到更大的城市發(fā)展自己事業(yè)，接踵而來(lái)的是，人們壓力劇增，生活節(jié)奏不規(guī)律，導(dǎo)致亞健康。亞健康的人群，身體雖然沒(méi)有患病，卻出現(xiàn)了生理機(jī)能減退，代謝水平低下，主要表現(xiàn)于疲勞、胸悶、頭痛、失眠、健忘、腰酸背痛、情緒不穩(wěn)定，工作效率低下等。呼吁養(yǎng)生的人群出現(xiàn)，比如枸杞菊花泡水有利于緩解疲勞。在日本也有以茶為原料的各種飲品，最近，在中國(guó)這些飲品也很暢銷，其中的營(yíng)養(yǎng)成分含量是否充足，暫且不明，不過(guò)，這是個(gè)不錯(cuò)的發(fā)展方向。中國(guó)的中醫(yī)歷史悠久，經(jīng)歷歷史的檢驗(yàn)，臨床實(shí)驗(yàn)表明，中藥材具有的功效是強(qiáng)大的，比如靈芝，靈芝是著名的一味藥材，將靈芝實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，提高靈芝活性物質(zhì)含量，是研究的關(guān)鍵。2．材料與方法2.1.材料、藥品及儀器2.1.1.菌種靈芝菌種：靈芝NA34，寧德師范學(xué)院發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室保藏。2.1.2.試劑主要所用試劑見表2-1-2表2-1-2主要試劑試劑名稱規(guī)格生產(chǎn)廠家乙醇分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司苯酚分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司硫酸分析純中國(guó)上海試劑香草醛分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司冰醋酸分析純西隴科學(xué)股份有限公司高氯酸分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司葡萄糖分析純天津市益力化學(xué)試劑有限公司磷酸二氫鉀分析純天津化學(xué)試劑有限公司酵母粉生物試劑北京奧博星生物技術(shù)有限公司氫氧化鈉分析純西隴科學(xué)股份有限公司蛋白棟生物試劑天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司2.1.3.基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分液體培養(yǎng)基（g/L）：40g葡萄糖，5g酵母粉，0.5g硫酸鎂，1.0g磷酸二氫鉀、4.0g蛋白胨。2.2.主要儀器主要所用儀器見表2-2。表2-2主要儀器設(shè)備名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家紫外可見分光光度計(jì)UV-5800PC上海元析儀器有限公司恒溫水浴鍋SB-1100上海愛朗儀器有限公司離心機(jī)3-16KL德國(guó)賽多利斯公司電子天平Y(jié)P802N上海精密科學(xué)儀器有限公司中藥粉碎機(jī)800A浙江永康市速鋒工貿(mào)有限公司恒溫培養(yǎng)搖床NRY-200上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司電熱恒溫水槽DK-8D上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司雙人單面凈化工作臺(tái)SW-CJ-2D蘇州凈化設(shè)備有限公司自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，GR-85-DR致微儀器有限公司2.3.方法2.3.1.Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Plackett-Burman法是在科學(xué)研究中常用的方法之一，是一種工藝優(yōu)化，能在相對(duì)少的實(shí)驗(yàn)中快速地從大量的影響因素里篩選出顯著影響因素。Plackett-Burman法適合使用在那些從眾多考察因素中迅速地、有效地篩查出關(guān)鍵的因素，以最少實(shí)驗(yàn)次數(shù)來(lái)精確估計(jì)各因素的主要效果。各個(gè)因素選擇高低兩個(gè)水平數(shù)值,該因素高低水平值的差距要小，差距是一致的，安排了12種配方的培養(yǎng)基，是為了保證不對(duì)其他因素效果有所妨礙。其自變量、編碼和水平因素見表2-3-1。表2-3-1Plackett-Burmandesign變量Variables因素（g/L）Factor低水平（-）Lowlevel高水平（+）HighlevelX1X2X3X4X5X6X7X8葡萄糖蔗糖dummy1dummy2果糖乳糖dummy3麥芽糖00-1-100-1015151115151152.3.2.菌種活化超凈工作臺(tái)上將菌種接種至液體培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)搖床上，28℃培養(yǎng)3d，讓菌絲繁殖。2.3.3.液體種子制備超凈工作臺(tái)上從液體培養(yǎng)基中吸取10mL菌絲體分裝到有不同碳源的80mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶，置于恒溫培養(yǎng)搖床上，160rpm/min、28℃培養(yǎng)5d，用于發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。2.3.4.液體發(fā)酵接種至不同配方的液體培養(yǎng)基中，務(wù)必準(zhǔn)確，過(guò)少會(huì)影響菌種生長(zhǎng)，更多搖床中容易灑出，沾染瓶口的細(xì)菌，污染培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為160rpm/min、28℃培養(yǎng)5d。2.3.5.生物量測(cè)定用紗布過(guò)濾樣品，用蒸餾水洗凈殘留的培養(yǎng)基等多余物質(zhì)，反復(fù)清洗3次。將菌絲體至于過(guò)濾紙上，放進(jìn)鼓風(fēng)干燥箱60℃烘至一夜恒重，（恒重即是第一次稱取后間隔一段時(shí)間再次稱取，前后重量不變，則達(dá)到恒重。）電子天平稱量，即為菌絲生物量。2.3.6.多糖測(cè)定（1）胞外多糖測(cè)定eq\o\ac(○,1)取到0.1mL發(fā)酵液，添加95%乙醇4mL，4℃冰箱過(guò)一夜；eq\o\ac(○,2)8000rpm離心后15min，棄掉上清液，往沉淀中加入3mL去離子水溶解混合均勻；eq\o\ac(○,3)吸取樣液0.01mL，加入0.99mL去離子水以及0.5mL5%苯酚震蕩勻，與2.5mL濃硫酸混合均勻后，靜置5min；eq\o\ac(○,4)100℃沸水浴里加熱15min，涼水冷卻，在490nm處測(cè)定吸光度值，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.0145x-0.0386，R2=0.9984。（2）胞內(nèi)多糖測(cè)定eq\o\ac(○,1)將菌絲體烘干磨成粉末，準(zhǔn)確稱取0.1g，加1mol/L氫氧化鈉5mol，用60℃水浴加熱1h；eq\o\ac(○,2)取0.01mL樣液，加入0.99mol去離子水，再加0.5mol的5%苯酚搖勻，加入2.5mL95%硫酸混勻，靜置5min；eq\o\ac(○,3)100℃沸水浴加熱15min，涼水冷卻，在490nm處測(cè)吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液多糖濃度。2.3.7.菌絲三萜含量測(cè)定eq\o\ac(○,1)菌絲干研磨成粉末，稱取0.1g，加入95%乙醇2.5mL，30℃搖床3h；eq\o\ac(○,2)取0.2mL,60℃水浴蒸干，分別加入香草醛-冰醋酸0.5mL和高氯酸溶液0.8mL,混勻；eq\o\ac(○,3)60℃水浴15min冷卻，最后加入2mL冰醋酸，靜置30min，以乙醇蒸干作為對(duì)照，于540nm處測(cè)吸光度值，以熊果酸為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.0065x+0.0065，R2=0.992。3．結(jié)果與分析3.1.Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3-1。采用Design-Expert軟件對(duì)表3-1中的胞外多糖、三萜、生物量，胞內(nèi)多糖含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)胞外多糖、三萜，胞內(nèi)多糖含量數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到各影響因子的偏回歸系數(shù)及其顯著性。表3-1Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果SerialnumberX1X2X3X4X5X6X7X8胞外多糖（g/L）三萜含量（%）生物量（g）胞內(nèi)多糖（g/L）1++-+++--2.490.650.426.92-++-+++-0.680.350.656.653+-+++1.80.520.677.394+-++-+++2.90.660.447.15--+-++-+3.040.950.545.556-+-++-++2.070.260.325.927++++-0.70.380.945.358++-++2.920.560.556.369+-++-1.730.690.725.810+++-+2.900.640.245.71192.312-++++2.710.380.468.22由表3-1可知，培養(yǎng)基添加果糖、乳糖，麥芽糖碳源組合時(shí)，碳源對(duì)靈芝胞外多糖的產(chǎn)量影響最大；培養(yǎng)基添加果糖、乳糖，麥芽糖碳源組合時(shí)，對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量的影響最大；培養(yǎng)基添加葡萄糖，蔗糖碳源組合時(shí)，對(duì)靈芝生物量的產(chǎn)量影響最大；培養(yǎng)基添加蔗糖，麥芽糖碳源組合，對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量影響最大。3.2.

Plackett-Burman分析不同碳源對(duì)靈芝多糖合成的影響表3-2為不同碳源對(duì)靈芝多糖合成的影響及貢獻(xiàn)值。表3-2胞外多糖偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析VariablesRegressioncoefficientE(x1)Contribution(%)SignificanceX10.0340.517.613X2-0.014-0.211.237X3-0.057-0.110.378X40.260.517.514X50.0180.282.216X60.0350.527.912X7-0.20-0.394.395X80.0971.4661.251從表3-2可以看出，麥芽糖（X8）對(duì)靈芝胞外多糖合成的影響最大，其次為乳糖（X6）。其中，葡萄糖、麥芽糖，乳糖對(duì)胞外多糖含量的影響是正效應(yīng)，蔗糖對(duì)胞外多糖含量的影響是負(fù)效應(yīng)3.3.

Plackett-Burman分析不同碳源對(duì)靈芝三萜合成的影響不同碳源對(duì)靈芝三萜合成的影響見表3-3所示。表3-3三萜含量偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析VariablesRegressioncoefficientE(x1)Contribution(%)SignificanceX10.0550.116.474X2-0.070-0.1410.472X30.0270.0531.527X40.0130.0270.388X50.0350.0702.625X60.140.2943.911X7-0.030-0.0061.926X80.0620.128.133從表3-3可以看出，蔗糖、麥芽糖和乳糖對(duì)三萜含量影響較大。其中，麥芽糖，乳糖對(duì)三萜含量的影響是正效應(yīng)，蔗糖對(duì)三萜含量的影響是負(fù)效應(yīng)。3.4.Plackett-Burman分析不同碳源對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖合成的影響不同碳源對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖合成的影響見表3-4所示，表3-4胞內(nèi)多糖偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析VariablesRegressioncoefficientE(x1)Contribution(%)SignificanceX10.360.736.672X20.350.711.506X30.611.214.423X40.791.577.391X50.360.721.545X60.180.360.397X70.0930.190.18X80.370.741.664可以看出，葡萄糖和麥芽糖對(duì)胞內(nèi)多糖含量影響較大。另外，葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖，乳糖對(duì)胞內(nèi)多糖含量的影響是正效應(yīng)。4小結(jié)與討論試驗(yàn)結(jié)果表明，不同碳源對(duì)靈芝多糖和三萜產(chǎn)量有顯著影響，培養(yǎng)基中加入果糖、乳糖，麥芽糖碳源組合對(duì)靈芝胞外多糖的影響最大；蔗糖、果糖，乳糖碳源組合對(duì)靈芝胞外多糖的影響最小。培養(yǎng)基中加入果糖、乳糖，麥芽糖碳源組合對(duì)靈芝三萜含量的影響最大；蔗糖、果糖，麥芽糖碳源組合的影響最小。培養(yǎng)基中加入葡萄糖，蔗糖碳源組合對(duì)靈芝生物量的影響最大；葡萄糖、蔗糖、乳糖，麥芽糖碳源組合對(duì)靈芝生物量的影響最小。培養(yǎng)基中加入蔗糖，麥芽糖碳源組合對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖的影響最大；葡萄糖，蔗糖碳源組合對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖的影響最小。曾曉希等[29]的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同碳源對(duì)靈芝胞外多糖合成含量的影響是葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞麥芽糖＞可溶性淀粉。乳糖:它是由半乳糖和葡萄糖過(guò)β-1,4糖苷鍵構(gòu)成的雙糖[30]。果糖：它是葡葡糖的同分異構(gòu)體.具左旋性,稱左旋糖[31]。蔗糖與麥芽糖是同分異構(gòu)體，都是二糖，蔗糖水解成一分子葡萄糖，一分子果糖。麥芽糖水解為二分子葡萄糖。葡萄糖，是一種單糖，一種多羥基醛。可以發(fā)現(xiàn)，單糖即是葡萄糖作為唯一碳源時(shí)，可以最好的合成靈芝多糖，被菌絲體直接利用，二糖要先水解為單糖后被菌絲體吸收，因而用單糖作碳源，合成的靈芝多糖含量多，生成的靈芝菌絲體生物量多。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，混合的碳源所合成的多糖與三萜含量多于單種碳源作為培養(yǎng)基的。本實(shí)驗(yàn)中，乳糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基，最適于菌絲體的生長(zhǎng)。李平作等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，在靈芝液體發(fā)酵過(guò)程中，可以清晰地觀察到菌體的形狀在前48小時(shí)里呈現(xiàn)為絲狀體，兩天后轉(zhuǎn)變成球狀體，第三天起部分絲狀體開始有所變化。菌球的外形體征可分為松散型和緊密型；球狀菌體其數(shù)量和直徑成反比。楊德等[33]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入天然成分，其產(chǎn)生的多糖含量相對(duì)多，其中的因果關(guān)系可能是蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)存在于天然物質(zhì)中，使得靈芝生長(zhǎng)具有豐富的營(yíng)養(yǎng)；或者,天然成分中的物質(zhì)將大分子物質(zhì)分解后吸收利用，存在的小分子物質(zhì)，類似于多糖片段的，則會(huì)造成檢測(cè)中測(cè)定的多糖含量增高。響應(yīng)面法，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為42h、發(fā)酵溫度為28.7℃時(shí)，在對(duì)應(yīng)條件下所生成的多糖含量最高，當(dāng)加入葡萄糖和蔗糖作為碳源時(shí)產(chǎn)生的生物量最高。實(shí)驗(yàn)中難免會(huì)因?yàn)椴僮鞑划?dāng)，或在搖瓶發(fā)酵中受到外界細(xì)菌的污染，因而在培養(yǎng)基中加入一定量的抗生素，防止污染發(fā)生，這樣實(shí)驗(yàn)才能順利進(jìn)行。參考文獻(xiàn)[1]戴玉成,曹云,周麗偉,吳聲華.中國(guó)靈芝學(xué)名之管見[J].菌物學(xué)報(bào),2013,(32):947-952.[2]J.Zhang,Y.J.Liu,H-S.AntitumoractivityofsulfatedextracellularpolysaccharidesofGanodermalucidumfromthesubmergedfermentationbroth[J].Carbohydr.Polym,2012(87):1539-1544.[3]E.Furusawa,S.C.Chou.AntitumouractivityofGanodermalucidum,anediblemushroom,onintraperitoneallyimplantedLewislungcarcinomainsynergenicmice[J].Phytother.Res,1992(6):300-304.[4]K.Koyama,T.Imaizum.AntinociceptivecomponentsofGanodermalucidum[J].PlantaMed,1997(63):224-227.[5]S.B.Lin,C.H.Li,S.S.Lee.Triterpene-enrichedextractsfromGanodermaluciduminhibitgrowthofhepatomacellsviasuppressingproteinkinaseC,activatingmitogen-activatedproteinkinasesandG2-phasecellcyclearrest[J].LifeSci,2003(72):381-2390.[6]H.Kohda,W.Tokumoto,K.Sakamoto.ThebiologicallyactiveconstituentsofGanodermalucidum(Fr.)Karst.Histaminerelease-inhibitorytriterpenes[J].Chem.Phar.Bull,1985(33):1367-1374.[7]B.Boh,M.Berovic,J.S.Zhang,Z.B.Lin.Ganodermalucidumanditspharmaceuticallyactivecompound[J].Biotechnol.Annu.Rev,2007(13):265-301.[8]M.Shi,Z.Y.Zhang,Y.N.Yang,AntioxidantandimmunoregulatoryactivityofGanodermalucidumpolysaccharide(GLP),Carbohydr[J].Polym.2013(95):200-206.[9]張瑞婷,周濤,宋瀟瀟,等.靈芝活性成分及其藥理作用的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2018,46(03):18-22.[10]劉松照,王國(guó)凱,彭燦,等.靈芝三萜類化學(xué)成分研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2017(4):41-46.[11]李廣遠(yuǎn),楊雅麗,王晶,等.靈芝多糖對(duì)NB4細(xì)胞凋亡及Egr-1表達(dá)的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2013,24(05):476-479.[12]梁磊,黃清鏵,王慶福,等．響應(yīng)面優(yōu)化微波一超聲波協(xié)同提取靈芝三萜工藝及其清除自由基活性[J].菌物學(xué)報(bào),2017(4):512-521.[13]王昕妍,陳國(guó)楊,蘇潔,等.靈芝孢子粉、破壁靈芝孢子粉對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)和VEGF表達(dá)的比較研究[J].中藥藥理與臨,2017(2):118-122.[14]劉聰,冉春梟,鐘民濤,等.靈芝多糖對(duì)3T3-L1胰島素抵抗細(xì)胞模型PI一3Kp85和GLUT4蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,20