基于藥用植物的杜鵑類菌根對(duì)越橘屬植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響

基于藥用植物的杜鵑類菌根對(duì)越橘屬植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響

杜鵑花植物，尤其是藍(lán)莓科植物，其根系沒有根毛，吸收能力遠(yuǎn)小于具有根毛的根系，無法有效吸收土壤中的水分和養(yǎng)分。然而，在自然條件下，大多數(shù)藍(lán)莓的細(xì)根都有內(nèi)生菌根的寄生蟲。這些物質(zhì)的抗生菌根的脆弱可以克服。藍(lán)莓的水分和養(yǎng)分吸收困難，從而改善植物的營(yíng)養(yǎng)狀況，調(diào)節(jié)主枝的代謝活動(dòng)，增強(qiáng)植物的抗逆性，提高藍(lán)莓的產(chǎn)量。早在1910年,Coville就首先在高叢越橘中發(fā)現(xiàn)菌根,并推測(cè)菌根真菌的侵染可能對(duì)越橘的生長(zhǎng)有益。李亞東等報(bào)道指出,Frieslehen于1936年首次從越橘根系中分離出了菌根真菌,發(fā)現(xiàn)其與大多數(shù)杜鵑花科植物有共生關(guān)系?；谠介倬闹匾?國(guó)內(nèi)外科研人員圍繞著越橘菌根菌多樣性、侵入動(dòng)態(tài)、共生等方面進(jìn)行了深入研究。1氮源類型及分布越橘菌根菌主要專性寄生杜鵑花科植物,因而這種菌根統(tǒng)稱為杜鵑花類菌根(Ericoidmycorrhizal,ERM),也稱為歐石楠類菌根。杜鵑花類菌根結(jié)構(gòu)極簡(jiǎn)單,不含叢枝、哈蒂氏網(wǎng)等特殊結(jié)構(gòu),菌根菌專一與杜鵑花科植物共生,因而杜鵑花類菌根真菌是菌根真菌中最為獨(dú)特的類型之一。杜鵑花科約有305屬3350種植物,寄主植物的多樣性在一定程度上決定了菌根真菌多樣性。目前已知,形成杜鵑花類菌根的真菌有盤菌屬、珊瑚菌屬和一些不產(chǎn)生子實(shí)體、僅見菌絲體的真菌類群。研究顯示杜鵑花科植物在世界上廣泛分布,而且大多生境條件惡劣,生存土壤多礦化率低、營(yíng)養(yǎng)貧瘠,與其共生真菌有著舉足輕重的關(guān)系;菌根對(duì)杜鵑花類植物的營(yíng)養(yǎng)吸收、增強(qiáng)對(duì)逆境因子的抗性等方面具有重要的作用。2植物菌根真菌感染的酶學(xué)特性菌根形成是一個(gè)相互對(duì)抗,最終形成平衡的過程。在杜鵑花類菌根菌和植物相互作用過程中,首先,真菌孢子萌發(fā)形成菌絲,產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶。目前已有較多杜鵑花類菌根真菌分泌細(xì)胞壁降解酶(如果膠酶、纖維素酶)、多酚氧化酶(如漆酶)的報(bào)道。一方面這些酶促進(jìn)菌根菌分解土壤中的植物殘?bào)w,為植物提供養(yǎng)分,如漆酶可降解土壤中單寧為植物提供N元素。另外,這些酶也在菌根菌侵入過程中發(fā)揮著重要作用,可破壞細(xì)胞壁,利于菌絲侵入形成共生體;但其酶活遠(yuǎn)低于植物病原真菌,過高的酶活、對(duì)植物細(xì)胞壁過大的破壞,可能會(huì)引起植物強(qiáng)烈的防御反應(yīng)。一般認(rèn)為杜鵑花類菌根真菌僅引起較輕微的防御反應(yīng),一些防御性物質(zhì),如多酚類物質(zhì)加速形成,但植物與真菌可能通過一系列“分子對(duì)話”(Crosstalk),使防御反應(yīng)逐漸消失,但其具體過程不詳。從酶學(xué)方面來看,杜鵑花類菌根真菌產(chǎn)生漆酶等多酚氧化酶,該酶可破壞酚類物質(zhì),可能破壞植物的防御體系,以利于菌根菌侵入。漆酶可能在菌根菌侵入過程中發(fā)揮重要作用,但菌根菌侵入是一個(gè)復(fù)雜的過程,漆酶是否與細(xì)胞壁降解酶協(xié)同作用尚不清楚。菌根菌的侵入及定殖受土壤因子(土壤pH、養(yǎng)分、類型、含水量、透氣性、微生物、重金屬離子等)、氣候和地理因素(溫度、光照、緯度等)、農(nóng)業(yè)措施(施肥、農(nóng)藥、灌溉、種植方式等)、寄主?；缘纫蜃拥挠绊?其中pH、土壤養(yǎng)分、透氣性、其它環(huán)境微生物對(duì)菌根菌定殖影響較大。在越橘菌根真菌研究中顯示,耕作土菌根真菌的侵染率明顯低于有野生越橘分布的森林土壤;土壤pH值低、營(yíng)養(yǎng)水平高的土壤中侵染率高于營(yíng)養(yǎng)水平低的干燥沙土。盆栽試驗(yàn)顯示,pH4.5時(shí)越橘菌根侵染率為69%,而pH6.5時(shí)侵染率僅4%。在云錦杜鵑研究中,有機(jī)氮作氮源,杜鵑花類菌根侵染率高于無機(jī)氮作氮源;有機(jī)氮源中,精氨酸、牛血清蛋白為氮源時(shí)侵染率較高,無機(jī)氮中硝態(tài)氮為氮源時(shí)侵染率高。杜鵑花類菌根中的內(nèi)生真菌或其它伴生菌也與菌根定殖密切相關(guān),如根際的擔(dān)子菌類可分解木質(zhì)素,為菌根提供營(yíng)養(yǎng)。一些研究中也發(fā)現(xiàn)了較多杜鵑花類菌根與植物內(nèi)生菌-深色有隔內(nèi)生菌(Darkseptateendophytes,DSE)伴生,二者侵染呈負(fù)相關(guān);DSE一般生存在自然環(huán)境條件惡劣或重金屬污染嚴(yán)重環(huán)境中,其對(duì)杜鵑花類菌根真菌的影響尚不確切。3信號(hào)分子的確定菌根形成過程中,植物和菌根菌都要發(fā)生一系列生理生化變化,通過一系列信號(hào)識(shí)別、交換和轉(zhuǎn)導(dǎo),最終激活植物和真菌一些基因表達(dá),從而引發(fā)復(fù)雜的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)變化。宿主植物根系產(chǎn)生的信號(hào)分子誘導(dǎo)真菌菌絲延伸,并在根附近形成分枝,最后與植物根發(fā)生物理接觸。此類信號(hào)分子來源于根系分泌物,由于植物根系分泌物成分復(fù)雜且濃度較低,很難區(qū)分哪些化合物具有信號(hào)分子的特性,基于對(duì)其它植物-微生物互作信號(hào)識(shí)別機(jī)制的認(rèn)識(shí),人們推測(cè)根系產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物極有可能充當(dāng)信號(hào)分子的角色。目前大多數(shù)研究主要集中于植物根系產(chǎn)生的次生代謝物,如黃酮、異黃酮、黃烷酮和苯基乙烯酮等。類黃酮曾被認(rèn)為是一種植物信號(hào)物質(zhì),能促進(jìn)或抑制AM真菌生長(zhǎng),但有研究顯示不能合成類黃酮的玉米突變體也能被AM真菌侵染,由此可知,類黃酮并不是叢枝菌根形成所必需的化合物誘導(dǎo)菌絲分枝因子。2005年,Akiyama等從日本百脈根(Lotusjaponicus)分泌物中分離出一種倍半萜類內(nèi)酯-獨(dú)腳金內(nèi)酯(Strigolactones),并證明其能夠誘導(dǎo)AM真菌菌絲分枝。獨(dú)腳金內(nèi)酯是植物與AM真菌聯(lián)系的必需信號(hào)物質(zhì),但獨(dú)腳金內(nèi)酯在AM共生系統(tǒng)中的水平調(diào)節(jié)機(jī)制尚不確切。目前菌根共生相關(guān)基因及信號(hào)分子研究主要集中于AM菌根,其它類型菌根鮮有報(bào)道。宿主根系分泌物中的信號(hào)物質(zhì)遠(yuǎn)不止獨(dú)腳金內(nèi)酯這一種,還有很多能被真菌識(shí)別的信號(hào)物質(zhì)有待提取分離和研究。真菌在宿主植物信號(hào)物質(zhì)的刺激下,能釋放可擴(kuò)散信號(hào)物質(zhì),促使一些相關(guān)植物基因的表達(dá)。早期即推斷AM真菌產(chǎn)生一種能夠誘導(dǎo)基因表達(dá)的信號(hào)物質(zhì)-菌根因子(Mycfactor)。Maillet等通過萃取、色譜純化、質(zhì)譜鑒定,解析了菌根因子的化學(xué)結(jié)構(gòu);與根瘤因子類似,是一種幾丁質(zhì)寡聚物(Lipochitooligosaccharide),可激活一些共生基因的表達(dá),能通過根瘤和AM菌根所必須的共同信號(hào)途徑來促進(jìn)菌根形成。4共同語(yǔ)言研究中對(duì)轉(zhuǎn)移組和蛋白質(zhì)組的利用4.1基于權(quán)值的共生體中共生相關(guān)基因表達(dá)與登記早期主要通過消減雜交(Subtractivehybridization,SH)、表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressedsequencetaq,EST)、抑制性消減雜交(Suppressionsubtractivehybridization,SSH)、基因表達(dá)序列分析(Serrialanalysisofgeneexpression,SAGE)、mRNA差異顯示技術(shù)(Differentialdisplay)、cDNA-AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism)等技術(shù)分析基因表達(dá)差異并獲得共生相關(guān)基因,之后再利用RealtimePCR、原位雜交、cDNA芯片技術(shù)分析共生相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)動(dòng)態(tài)和組織特異性,最后再通過超表達(dá)、RNAi(RNAinterference)和TILING(Target-inducedlocallesionsingenomes)等反向遺傳學(xué)技術(shù)了解共生相關(guān)基因功能。相關(guān)研究較多,但多數(shù)集中于基因表達(dá)差異分析方面。Voiblet等利用cDNA文庫(kù)、SSH差異篩選的方法,獲得了65個(gè)共生差異表達(dá)基因,主要包括細(xì)胞壁和膜合成、防御反應(yīng)、蛋白降解等,并進(jìn)一步利用cDNA芯片技術(shù)對(duì)關(guān)鍵基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)水平進(jìn)行了分析。Siciliano等分析了AM真菌附著胞形成階段的基因轉(zhuǎn)錄變化,通過文庫(kù)篩選,獲得了107個(gè)備選專化基因,經(jīng)雜交、突變體分析,5個(gè)基因?yàn)楦街纬申P(guān)鍵基因?？傮w來看,大體1%~4%基因在共生階段表現(xiàn)差異性變化,多數(shù)上調(diào),較多與蛋白合成與加工、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。SSH、cDNA-AFLP等技術(shù)主要通過間接手段將轉(zhuǎn)錄組的一些變化在一定程度上顯示出來,具有一定的片面性,近年來較多研究開始探索基于高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因芯片技術(shù)來高通量、系統(tǒng)化分析轉(zhuǎn)錄組變化。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠在單核苷酸水平對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè),可有效分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平?；蛐酒夹g(shù)的優(yōu)點(diǎn)也在于其可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè),研究方法較成熟,但只限用于已知序列。Sebastiana等利用基因芯片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,從板栗中鑒定出了一個(gè)共生相關(guān)基因,其主要在共生體早期聯(lián)系(6~12h)中發(fā)揮功能。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序無需設(shè)計(jì)探針,即可對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄信息進(jìn)行檢測(cè),可提供更精確的數(shù)字化信號(hào)、更廣泛的檢測(cè)范圍以及更高的檢測(cè)通量。此外,高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠精確分析基因的表達(dá)水平,比芯片可多檢測(cè)出30%的差異表達(dá)基因。此外,近來一些基于單細(xì)胞高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的技術(shù)正在逐步成熟,Tang等報(bào)道了單細(xì)胞高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),其主要通過加adaptor引物、二次擴(kuò)增來提高核酸數(shù)量。盡管該方法存在無法分析無poly(A)mRNA、獲得序列數(shù)量較少、序列較短等缺點(diǎn),但其對(duì)于細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組差異分析具有重要意義。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序缺點(diǎn)在于成本較高,隨著測(cè)序技術(shù)飛速進(jìn)步,其檢測(cè)成本也在快速下降。4.2轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組差異及互補(bǔ)性研究蛋白質(zhì)組學(xué)旨在建立不同時(shí)間與空間的生物組織細(xì)胞所有表達(dá)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)表達(dá)譜,利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可有效分析真菌共生階段的蛋白質(zhì)差異。Zhang等利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),發(fā)現(xiàn)共生菌侵入階段,組織中較多蛋白上調(diào),其中一關(guān)鍵蛋白經(jīng)鑒定為病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-relatedprotein,PR),經(jīng)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增,獲得了2個(gè)PR蛋白的序列,RealtimePCR證明僅其中1個(gè)基因表達(dá)上調(diào)?；谝恍┨m科植物次生代謝產(chǎn)物具有較高的藥用價(jià)值,較多研究集中于蘭科菌根共生差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究。朱江敏利用雙向熒光差異電泳結(jié)合質(zhì)譜分析,從石斛菌根中發(fā)現(xiàn)了46個(gè)共生差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中最大的功能類群是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白,約占22%。在福建金線蓮與菌根真菌互作蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,獲得了22個(gè)差異蛋白點(diǎn),其功能較多涉及植物信號(hào)傳導(dǎo)、代謝調(diào)節(jié)及光合作用,推測(cè)菌根真菌可能通過與植物相互作用,使植物代謝及光合作用增強(qiáng),從而表現(xiàn)植株健壯、抗性增強(qiáng)。轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的首要目的都是獲得基因的表達(dá)情況,二者大部分是相互關(guān)聯(lián)的。利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的差異和互補(bǔ)性,同時(shí)對(duì)生物體特定狀態(tài)下的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行全方位度量,可獲得表達(dá)譜的“全景圖”,并挖掘受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的基因,這是當(dāng)前一個(gè)重要發(fā)展方向。Fan等利用基因芯片及iTRAQ技術(shù)對(duì)甜橙感染黃龍病的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析,2種方法皆顯示防御反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)明顯上調(diào),顯示轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組相結(jié)合可增強(qiáng)對(duì)植物防御反應(yīng)機(jī)理的理解。5做好菌株篩選工作總體上來看,目前國(guó)外圍繞著越橘杜鵑花類菌根菌的多樣性、菌根侵入動(dòng)態(tài)、定殖影響因子、共生相關(guān)基因及信號(hào)分子等方面已有較多報(bào)道。國(guó)內(nèi)對(duì)越橘杜鵑花類菌根菌的研究還處于起始階段,相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少,已有報(bào)道主要圍繞菌根調(diào)查、菌根菌分離、促生作用等方面進(jìn)行。總體來看,杜鵑花類菌根研究基礎(chǔ)較薄弱,有必要在以下方面加大研究力度:一是信號(hào)分子方面,分析已知信號(hào)分子的具體應(yīng)用效果,篩選未知信號(hào)分子;二是共生相關(guān)基因方面:基于高通量測(cè)序技術(shù)加速共生相關(guān)差異表達(dá)基因的分離速度;分析有菌絲細(xì)胞和無菌絲細(xì)胞二者在轉(zhuǎn)錄水平上的差異;借鑒AM菌根、根瘤的研究策略,基于杜鵑花類菌根的特異性,探索是否具有特殊的共生相關(guān)基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;三是功能基因組方面,將轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組與代謝組相結(jié)合,綜合分析各共生相關(guān)基因的功能及蛋白合成途徑;四是菌根菌資源方面,目前已報(bào)道的杜鵑花類菌根菌資源可能僅是極小的一部分,有必要不斷挖掘新