第六章 化學毒物的一般毒性作用-急性毒性

第六章外源化學物的一般毒性作用毒性作用？一般毒性作用：也稱基礎(chǔ)毒性作用，指外源性化學物在一定的劑量、一定的接觸時間和一定的接觸方式下對機體（實驗動物和人類）產(chǎn)生綜合毒效應(yīng)的能力?？煞譃榧毙远拘?、重復劑量毒性、亞慢性毒性和慢性毒性。特殊毒性作用：包括致突變、致癌、致畸，簡稱為“三致”。第一節(jié)急性毒性作用一、概念和試驗?zāi)康?．概念急性毒性（acutetoxicity）是指機體（實驗動物或人）一次接觸或24小時內(nèi)多次接觸一定劑量外源化學物后在短期（最長到14天）所引起的機體的毒性效應(yīng)（包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化等），以及死亡效應(yīng)。實際工作中，機體接觸化學毒物的方式或途徑不同，急性接觸的含義也有所不同。一次接觸是指瞬間給實驗動物染毒，如經(jīng)口染毒、經(jīng)注射途徑染毒。經(jīng)呼吸道與經(jīng)皮膚染毒而言，則是指在一個特定的期間使實驗動物持續(xù)地接觸化學物的過程。當化學物毒性很低，需要給予動物較大劑量時，可在24小時內(nèi)分多次給予，這時的急性接觸即為“多次”，一般不超過三次。急性接觸的時間和次數(shù)中毒效應(yīng)出現(xiàn)的時間急性毒性效應(yīng)一般是指機體接觸化學物后，在較短時間內(nèi)觀察到的毒性癥狀。有的化學毒物在實驗動物接觸幾分鐘內(nèi)即可產(chǎn)生嚴重中毒癥狀，甚至瞬間死亡；而有些化學毒物幾天、十幾天后動物才產(chǎn)生明顯的中毒癥狀和死亡，呈現(xiàn)遲發(fā)毒效應(yīng)。有的化學毒物在出現(xiàn)快速和劇烈的毒效應(yīng)后很快恢復；有的化學物早期僅有較輕微癥狀，幾天后又出現(xiàn)嚴重中毒癥狀甚至死亡。在實際工作中，大部分毒物的急性毒性癥狀在短期內(nèi)出現(xiàn)，一般為7~14天。2．急性毒性試驗的目的測定毒物的致死劑量以及其他急性毒性參數(shù)，LD50為最主要的參數(shù)，并根據(jù)LD50值進行急性毒性分級。其他毒性參數(shù)還有LD100、LD01、LD0等。通過觀察動物中毒表現(xiàn)，毒作用強度和死亡情況，初步評價毒物對機體的毒效應(yīng)特征、靶器官、劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）和對人類的潛在危險性程度。為重復劑量、亞慢性和慢性毒性研究及其他毒性試驗提供接觸劑量的設(shè)計依據(jù)，并為觀察指標的選擇提出建議。為毒理學機制研究提供初步線索。

3．有關(guān)急性毒性試驗常見的參數(shù)急性毒性上限參數(shù)，以死亡為終點：半數(shù)致死劑量或濃度（LD50或LC50）；絕對致死劑量或濃度（LD100或LC100）；最小致死劑量或濃度（MLD，LD01或MLC，LC01）；最大耐受劑量或濃度（MTD，LD0或MTC），或稱為最大非致死劑量（MNLD）。急性毒性下限參數(shù)，以非致死性急性毒作用為終點：觀察到有害作用的最低水平（急性毒性LOAEL）；未觀察到有害作用的水平（急性毒性NOAEL）。因此，急性毒性試驗可以分為兩類。一類是以死亡為終點，以檢測受試物急性毒性上限指標為目的的試驗，這類試驗主要是求得受試物的LD50值。另一類急性毒性試驗檢測非致死性指標。二、實驗動物選擇1．選擇原則一般原則：毒性反應(yīng)與人相近；操作方便，易飼養(yǎng)和管理；品系純，價格低，易獲取；選擇兩種（嚙齒類，非嚙齒類）以上動物分別求其急性毒作用參數(shù)。其他條件選擇：年齡：剛成年的健康動物；性別：雌、雄各半；雌、雄分籠喂養(yǎng)；分組：隨機分組；檢疫期：1~2周，如是貓、狗，則須檢查腸道寄生蟲或直接驅(qū)蟲治療。2．選擇方法種屬的選擇：脊椎動物的大小、生命周期、生育行為都較為適宜，有些已被訓化，有利于被培育成標準動物。最主要的急性實驗動物是大鼠，幾乎占全世界所報導的研究外源化學物急性毒性試驗的一半，占第二位的是小鼠。

為什么要選大、小鼠呢？

因為它的毒性反應(yīng)與人較為一致，而且繁殖快、易飼養(yǎng)、價格便宜且易獲取。使用實驗動物來推論于人必須慎而慎之。因為動物的反應(yīng)敏感性一般不及人。曾有報導發(fā)現(xiàn)有138種化合物人對之反應(yīng)比大鼠更為敏感。人與大鼠對不同化合物的急性毒性敏感比值

化合物種類化合物數(shù)目敏感比值*無機化合物404.2±0.66有機磷化合物161.9±0.46有機氯化合物201.8±0.30藥物6210.5±5.80*以大鼠為1，人：大鼠另外，由于不同種屬動物其生理狀況不一，在做實驗時要根據(jù)實驗需要注意：嚙齒類動物：無嘔吐反應(yīng)貓、狗：嘔吐反射靈敏，可用于研究引發(fā)嘔吐的實驗。兔、豚鼠：多用于經(jīng)皮膚接觸的毒作用研究。猴：用于一些特殊的實驗。年齡和體重的選擇動物種類壽命(年)成年體重選擇范圍時間(月)體重(克)急性試驗慢性試驗小鼠1.5~221518~2515~18大鼠2.0~2.53150180~24050~100豚鼠6~82250200~250150~200家兔4~93~415002000~25001200~1500貓10~123~410001500~25001000~1500小狗---1500~25001200~2000狗15~203~48000~150004000~6000急、慢性實驗動物年齡、體重選擇動物分組的均衡性和隨機性均衡性：要求每組動物的平均體重和體重的離散度盡可能一致，具體來說：每組實驗動物之間的平均體重相差不應(yīng)超過10％——控制均衡性；每組實驗動物的體重不應(yīng)超過全體實驗動物平均體重的20％——控制離散度；隨機性：每只動物分散到各組中去的機會是均等的，以避免成見和系統(tǒng)誤差。實驗分組與動物數(shù)量在利用不同的方法測定化學物LD50時，實驗設(shè)計中對動物數(shù)量的要求不同。一般要求雌雄兼用，每個劑量組每種性別至少5只動物，至少設(shè)置3個不同的劑量組（一般為5-7個劑量組）。霍恩氏法測定LD50要求有4個劑量組，每組4-5只動物。概率單位法測定LD50要求5-7個劑量組，每組10只或以上動物。在對不同的化學物測定時，也應(yīng)根據(jù)其相應(yīng)的試驗規(guī)程確定實驗動物數(shù)量。實驗動物的預(yù)檢適應(yīng)性飼養(yǎng)1-3周左右，選擇健康的動物。大鼠、小鼠、豚鼠、兔的檢疫期為1周犬、猴可適當延長至2-3周設(shè)定檢疫期的目的：讓實驗動物在本實驗室條件下適應(yīng)一段時間，減少環(huán)境和生理條件變化可能對試驗結(jié)果的影響；篩檢健康狀況等不符合試驗要求的動物。1）初設(shè)劑量組以了解的LD50值為中間劑量組的劑量，按一定的比值，再向上或下各推1-2個劑量組，開始時，組距要稍大些。例如：某受試物相關(guān)文獻查閱結(jié)果，其大鼠經(jīng)口LD50約為40mg/kg，可按此劑量倍數(shù)差４，對數(shù)劑量差0.6（lg4=0.6）為組距，劃分上下各兩組。3.劑量分組與設(shè)計組別劑量(mg/kg)對數(shù)劑量1.2.51.6021-2×0.62.10.01.6021-0.63.40.01.60214.1601.6021+0.65.6401.6021+2×0.6某化合物預(yù)實驗劑量表如果估計受試物致死劑量范圍較窄，也可將組距縮小，例如以劑量倍數(shù)1.6，對數(shù)劑量差0.2（lg1.6=0.2）為組距，此時上表的范圍縮小。某化學物預(yù)實驗劑量表組別劑量(mg/kg)對數(shù)劑量1.15.6251.6021-2×0.22.251.6021-0.23.40.01.60214.641.6021+0.25.102.41.6021+2×0.22）按預(yù)實驗求得大概劑量范圍后（即10%-90%或0-100%）再按下式求正式試驗的組距。i=或i=

（n=組數(shù)）3）各實驗組劑量=最低劑量組的對數(shù)值+i，然后再反對數(shù)求得。4）一般測定LD50，設(shè)為5-7組。過多→浪費；過少→不準確。各組動物數(shù)相等：小鼠每組不少于10；大鼠6-8；兔4-6；各組實驗動物雌雄各半，必要時還要分別求雌雄動物的LD50；急性毒性試驗中，當高劑量達到5g/kg時，實驗動物仍無明顯毒性，或雖有毒性體征但無死亡，此時一般可不再求LD50。三、受試物及處理受試物的接受、分樣、保管、秤重、配制以及在此過程中嚴格的質(zhì)量保證影響急性毒性實驗的結(jié)果。受試物劑型：水溶液、混懸液、油溶液。給藥容積的大小，根據(jù)染毒途徑和實驗動物物種來確定。各種染毒途徑的最大容積，以受試動物的物種或劑量確定，一般規(guī)定染毒的最大容積為：①經(jīng)口：20ml/kg（對空腹動物）；②經(jīng)皮：2ml/kg；（根據(jù)體表面積計算）；③靜脈注射：1ml/kg（5分鐘以上）；④肌肉注射：0.5ml/kg（一個部位）；⑤吸入：2mg/L；⑥眼：每眼0.01ml；⑦鼻：猴或狗每鼻孔0.1ml；⑧直腸：0.5ml/kg；⑨陰道：大鼠0.2ml，兔1ml。四、經(jīng)典急性毒性試驗方法

＊經(jīng)胃腸道＊經(jīng)呼吸道＊經(jīng)皮膚＊其它途徑：注射1．經(jīng)胃腸道途徑用于觀察：能否經(jīng)胃腸道吸收及吸收情況吸收速度致死劑量染毒方式：１）灌胃２）喂飼３）吞咽膠囊經(jīng)口染毒的重要注意事項：“禁食”經(jīng)口接觸，動物應(yīng)事先禁食，以防止胃內(nèi)容對化合物毒性的影響。禁食期間正常給予飲水，染毒2小時后提供飼料。大、小鼠主要在夜間進食，故應(yīng)隔夜禁食，如預(yù)計第二天上午給藥，則在凌晨開始就應(yīng)禁食。家兔、狗等在上午喂食前給予受試物，即可達到空腹的目的。例如大鼠食入NaCl：禁食時LD50為3.75g/kg；不禁食時LD50為6.14g/kg。１）灌胃

優(yōu)點：直接入胃，不與口腔、食管粘膜接觸而致吸收；劑量準確；如空腹給予，尚能消除胃內(nèi)容的影響；缺點：工作量大；長期、多次應(yīng)用易致食道粘膜損傷。方法等體積給藥：即單位體重所給予的藥物（重量或體積mg/kg；ml/kg）應(yīng)一致。因為成年動物的胃容量與體重之間有相關(guān)，按單位體重計算灌胃液的體積可使受試物吸收速度相對穩(wěn)定。一次灌胃體積小鼠：0.2-1ml/只(0.1-0.5ml/10g)大鼠：<5ml/只(0.5-1ml/100g)（也有要求<3ml/只）家兔：<10ml/2kg狗：<50ml/10kg２）喂飼優(yōu)點：符合人類接觸毒物的實際情況。缺點：受試物如有異味，動物拒食，也存在口腔粘膜吸收的可能性；受試物如有揮發(fā)性，可使劑量下降，并存在呼吸道吸入等交叉吸收；受試物如易水解或與飼料中某些成分發(fā)生反應(yīng)，易影響毒效應(yīng)；為準確掌握每個動物的實際攝入量則需分籠喂養(yǎng)，還需折算實際攝入量，比較繁瑣。一般急性毒性試驗不用喂飼法。３）吞咽膠囊

優(yōu)點：劑量準確，尤其適用于易揮發(fā)、易水解、有異味的化合物；兔、貓、狗等大動物常用此法。缺點：不適用于大鼠、小鼠。2．經(jīng)呼吸道途徑研究外來化合物經(jīng)呼吸道接觸的目的：能否造成呼吸道損傷能否經(jīng)呼吸道吸收及其中毒特點吸收速度致死劑量（即LD50）經(jīng)呼吸道接觸外來化合物的方式有二：吸入呼吸道注入1）吸入接觸優(yōu)點：與實際情況較相符；缺點：吸入成分復雜。（1）靜式吸入優(yōu)點：設(shè)備簡單、操作方便、消耗動物少。目前仍較常用。缺點：接觸環(huán)境密閉；O2分壓下降，CO2分壓升高，溫度升高，濕度升高；受試物濃度逐漸降低（皮毛、桶壁等的吸附）；存在交叉接觸（胃腸道、呼吸道、皮膚）；接觸時間、放置動物數(shù)和染毒柜容積均有一定限制。實驗動物最低需氣量及不同體積染毒柜放置的動物數(shù)

動物種屬呼吸通氣量(L/h)最低需氣量(L/h)不同容積染毒柜放置動物數(shù)*25L50L100L300L小鼠1.453.453~56~1012~1536~40大鼠10.0830.511~25~6

注：*按吸入2小時計為防止出現(xiàn)缺氧與二氧化碳滯留現(xiàn)象，要求在接觸期內(nèi)染毒柜的O2分壓不能低于19%，CO2分壓不能超過1.7%。較大動物一般不使用靜式染毒吸入方法，若使用則染毒柜的容積要相應(yīng)增大。如家兔每小時最低需氣量為250L，猴為300L，可依此推算染毒柜的體積。

（2）動式吸入指動物置于有空氣流動的染毒柜中，此裝置具有動力部分，能使新鮮空氣不斷進入，污濁空氣不斷排出，有不斷補充受試物的配氣部分。從而使染毒柜內(nèi)的受試物濃度比較穩(wěn)定，氧分壓恒定、二氧化碳分壓恒定，這樣可以使得接觸時間不受限制。動式吸入裝置如圖動式接觸有二種形式：動式吸入接觸：有皮膚接觸面罩吸入接觸：無皮膚接觸動式接觸的優(yōu)、缺點：優(yōu)點：染毒時間可不受限，染毒濃度相對穩(wěn)定；缺點：消耗受試物多，設(shè)備復雜。2）氣管內(nèi)注入在實驗動物麻醉的情況下，將已消毒滅菌的受試物（粉塵旋液或液體）注入氣管，使之分布于左右肺內(nèi)。這種方式多用于制造急性中毒模型，而不常用于急性毒性試驗。3．經(jīng)皮膚接觸研究外源化學物經(jīng)皮膚接觸的目的：能否經(jīng)皮膚吸收及其毒性特征能否引起皮膚損傷吸收速度致死劑量皮膚是多層結(jié)構(gòu)，外來化合物只有穿透角質(zhì)層達到真皮才能吸收入血。因此研究經(jīng)皮膚吸收是指對完整皮膚而言。經(jīng)皮膚吸收有四種結(jié)局：①不穿透、不損傷；或少量吸收，但很快降解，無中毒反應(yīng)出現(xiàn)。②經(jīng)皮膚吸收導致中毒，最終死亡。③局部刺激或損傷，不伴有全身中毒。④皮膚過敏、光敏反應(yīng)。1）經(jīng)皮膚吸收研究動物選擇：皮膚解剖、生理特征與人相近的豚鼠、家兔或小型豬。①定性試驗浸尾試驗：一般大鼠尾部浸兩小時兔耳法：觀察雙側(cè)兔耳變化②定量試驗在試驗動物脫毛部位定量涂布受試化合物，以求出經(jīng)皮接觸的劑量-反應(yīng)關(guān)系。脫毛方法：化學法：脫毛劑硫化鋇＋滑石粉１:４硫化鈉＋淀粉１:４機械法：剪剃去毛脫毛部位：兔、豚鼠背部中線兩側(cè)大鼠尾部、背部中央或腹部脫毛面積：體表面積的10-15%體表面積=10.4W0.667(W指體重)脫毛后必須觀察24小時，確認無皮膚損傷后才能進行實驗。實驗方法：可用玻璃鐘罩法，接觸受試物2-6小時，接觸劑量以mg/kg或mg/cm2表示。2）局部皮膚作用研究局部作用研究可以結(jié)合皮膚吸收試驗一起觀察，也可以單獨進行。①局部作用研究與經(jīng)皮吸收實驗共同進行：取下玻璃鐘罩后，觀察局部中毒反應(yīng)。經(jīng)皮吸收毒性試驗所用劑量大，有時尚未取下玻璃鐘罩，動物可能已經(jīng)死亡，因此不一定能觀察到完整的局部損傷的變化。

②單獨設(shè)計局部作用研究斑帖法在脫毛區(qū)（1cm2），帖敷浸有受試物的多層紗布，劑量小于致死劑量，再蓋上油紙或塑料布，貼牢并固定，12-24小時解開，觀察皮膚反應(yīng)。皮膚反應(yīng)評分很淡的紅斑(幾乎觀察不到)1邊界清晰的紅斑(淡紅→鮮紅)2中等嚴重的紅斑(鮮紅→深紅)3有紅斑及輕微焦痂出現(xiàn)4皮膚反應(yīng)評分很輕微的水腫(幾乎觀察不到)1輕度水腫(邊緣輕度高出表皮)2中等水腫(邊緣高出表皮1mm)3重度水腫(邊緣高出表皮1mm以上并超過涂抹范圍)4紅斑、焦痂評分標準

以水腫過程為評分標準

皮膚反應(yīng)評分表由于皮膚局部刺激損傷往往發(fā)展過程緩慢，一般評價24小時反應(yīng)或72小時反應(yīng)，取其平均值，稱為“原發(fā)性刺激指數(shù)”。指數(shù)＜2分輕度刺激指數(shù)2-5分之間中等刺激指數(shù)>6分重度刺激4．注射途徑接觸是研究外源化化學物毒性作用的特殊方式，一般僅用于幾種化合物毒性的比較，化學物的代謝、毒物動力學或藥物的研究。靜脈注射；皮下注射；腹腔注射；肌肉注射等。

五、急性毒性替代試驗＊固定劑量法＊急性毒性分級法＊上－下移動法1、固定劑量法不以動物死亡為觀察終點，預(yù)先選定的或固定的一系列劑量染毒，如5、50、500mg/kg，最高限量是2000mg/kg。觀察毒性反應(yīng)，對化學物毒性進行分級。

EEC的急性經(jīng)口毒性分級標準為：高毒(LD50<25mg/kg)有毒(LD50為25－200mg/kg)有害(LD50為200－2000mg/kg)不分級(LD50>2000mg/kg)平均用大鼠14.8只，經(jīng)典方法平均用大鼠24.2只。2、急性毒性分級法以死亡為終點的分階段試驗法，每階段3只動物，平均經(jīng)2～4階段，根據(jù)死亡動物數(shù)，判斷急性毒性。首選大鼠，從25、200、2000mg/kg體重3個固定劑量中選擇一個劑量開始試驗，根據(jù)結(jié)果判斷：①不需要進一步試驗進行分級；②下一階段以相同劑量的另一種性別試驗；③下一階段以較高或較低的劑量水平進行（從200mg/kg體重開始）。動物觀察14天，染毒當天觀察體征和死亡至少兩次，之后每日觀察一次。每周測體重，所有動物進行大體解剖，必要時進行組織病理學檢查。3、上－下移動法（階梯法）以死亡為終點，也可用于觀察不同的終點。根據(jù)初步資料確定第一只動物接受化學物的劑量，由第一只動物染毒后的反應(yīng)決定第二只動物的接受劑量，如死亡則下一個劑量降低，如存活則下一個劑量增高。該方法需要選擇一個比較合適的劑量范圍，使得大部分動物的所接受的化學物劑量在真正的平均致死劑量左右。方法改進后，僅需要6～9只動物。六、毒性作用觀察1.觀察時間一般要求的觀察時間為14天許多化學物在動物接觸后很快死亡，如有機磷農(nóng)藥、氰化物。也有些化學物所致的中毒癥狀發(fā)展遲緩，可出現(xiàn)遲發(fā)性死亡，如羰基鎳、鉈。另外，由于動物個體差異，死亡時間也不同。如小鼠腹腔注射過氧化二碳酸二環(huán)己酯（DCPD），同一組動物的最早死亡時間為注射后7小時，最遲為150小時（6天）。觀察時間可隨具體情況設(shè)為24小時，3天，7天等。如觀察時間過長超過14天，有時不能區(qū)分動物是由于中毒死亡，還是因其它原因所致，因而也無必要。值得注意的是，任何LD50或相關(guān)參數(shù)測定，均應(yīng)標明接觸時間。2.癥狀觀察目的：觀察外源化學物急性毒性的重要環(huán)節(jié)，同時可以彌補LD50參數(shù)的不足。內(nèi)容：中毒的發(fā)生、發(fā)展、規(guī)律；體重改變；死亡前癥狀、特點，死亡時間等。嚙齒類動物化學物中毒主要觀察內(nèi)容

系統(tǒng)和器官中毒后常見表現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)肌肉系統(tǒng)體位異常,叫聲異常,活動增多,呆臥少動,肌顫,痙攣,抽搐麻痹,后肢無力,運動失調(diào),管狀尾,對外界刺激過敏或遲鈍植物神經(jīng)系統(tǒng)瞳孔擴大,流口水,流淚,出汗呼吸系統(tǒng)鼻孔溢液,鼻翼煽動,呼吸深緩,呼吸過速,張口或腹式呼吸泌尿生殖系統(tǒng)會陰部污穢,有分泌物,陰戶或乳腺腫脹,陰莖突出,遺精皮膚和被毛皮膚充血,紫紺,被毛蓬松,污穢眼睛眼球突出,充血,角膜渾濁,血性分泌物有的化學物能夠使動物很快出現(xiàn)興奮癥狀，如氰氫酸和丙烯腈對大、小鼠染毒后，都很快出現(xiàn)興奮。有的化學物給動物染毒后，動物出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，直至死亡。例如：除草劑新燕靈給大、小鼠灌胃致死劑量，動物很快表現(xiàn)為閉目靜臥、四肢無力、站立不穩(wěn)、步態(tài)蹣跚、呼吸減慢，最后缺氧、口鼻青紫死亡。有些化學物結(jié)構(gòu)相似，但毒性表現(xiàn)也有差別。含有氨基的氰氫酸和丙烯腈對大、小鼠染毒后，都很快出現(xiàn)興奮。染毒丙烯腈的動物首先出現(xiàn)活動增加、騷動、竄跑、甚至跳躍，之后出現(xiàn)呼吸困難，耳與尾青紫色；而氰氫酸呈一過性興奮，呼吸加快、加深，然后呼吸困難，耳與尾則為桃紅色?？梢娡瑸榍杌?，其中毒表現(xiàn)和機制有所不同。在觀察期內(nèi)還需多次測量動物體重，體重改變可以反映動物染毒后的整體變化。實驗動物染毒后的死亡時間也應(yīng)記錄和分析，有時死亡時間的分析可以提供一些重要信息。久效磷小鼠經(jīng)口與腹腔注射染毒，均呈現(xiàn)隨染毒劑量增加，死亡時間縮短，死亡時間與染毒劑量之間呈直線負相關(guān)，提示實驗動物致死是可能由于化學物原形所致。DCPD給大鼠腹腔注射染毒，染毒劑量對數(shù)值與死亡時間呈明顯負相關(guān)；但給小鼠腹腔注射染毒，則無明顯相關(guān)?？赡芘c化學物在大鼠和小鼠體內(nèi)代謝不同有關(guān)。

3.病理和其它指標觀察對死亡的動物應(yīng)及時做大體解剖檢查，觀察內(nèi)臟器官有無出血、壞死等，對有變化的器官應(yīng)進行病理組織學檢查。如果有陽性發(fā)現(xiàn)，應(yīng)以此為線索，進行下一步研究，為之后的亞慢性和慢性毒性試驗提供參考觀察指標。第二節(jié)急性毒性試驗程序

與急性毒性評價一、急性毒性試驗程序受試物資料的采集：化學結(jié)構(gòu)式、理化性質(zhì)、純度等，或查閱文獻，搜集與之相近的化學物毒性資料。實驗室的要求：GLP。實驗動物的選擇原則，年齡和體重等。實驗動物的分組的隨機性與均衡性。受試物劑量的分組確定。選定染毒途徑，符合人類實際接觸情況。中毒表現(xiàn)的觀察，相關(guān)參數(shù)的計算。毒性分析。二、半數(shù)致死量與急性毒作用帶1.LD50（LC50）應(yīng)用中需注意的問題:

1927年Trevan引入了半數(shù)致死量LD50（LC50）的概念來評價急性毒性，此后該指標得到廣泛應(yīng)用，并成為急性毒性的主要指標。①LD50（LC50）的波動性LD50（LC50）是一個統(tǒng)計量，它受到許多因素的影響，包括實驗動物的物種、品系、性別、年齡、受試化學物的濃度、稀釋溶液的性質(zhì)、喂養(yǎng)條件以及操作者的熟練程度等。因此，在比較不同實驗室的LD50時要考慮到各種影響因素的存在，以及實驗條件的等同性。另外，即使各個條件都相同，由于實驗動物的抽樣誤差，LD50的差別依然存在。

同一化學物不同實驗室LD50測定結(jié)果的差異

染毒途徑毒物總數(shù)平均差異倍數(shù)最大差異倍數(shù)經(jīng)口20513吸入203.811皮下301.874.8經(jīng)皮未說明1.744腹腔251.251.8曾經(jīng)有研究組織13個國家的11個實驗室，統(tǒng)一主要的實驗條件對5種化學物的LD50進行測定。根據(jù)收集到的80個實驗結(jié)果分析，結(jié)果仍存在相當大的差別，可達2.44~8.38倍。

化合物范圍（mg/kg）比值（max/min）五氯酚74~6208.38水楊酸鈉930~23282.50苯胺479~11692.44乙酰苯胺723~30604.23氯化鎘105~4824.59LD50（LC50）雖然是一個重要的急性毒性參數(shù)，但它只能表示一種外源化學物引起實驗動物死亡一半的劑量(或濃度)，即一半死亡、一半存活的劑量界限，所以它是一個質(zhì)反應(yīng)。LD50（LC50）給予有效信息較少，實用性有限，有其局限性，表現(xiàn)在它不能反映急性毒性作用的特征，也不能反映其毒作用帶的寬或窄。因此，為彌補LD50（LC50）的不足，實驗中還要詳細描述實驗動物的中毒特征，并選擇其它的參數(shù)，如急性毒作用帶。②LD50

（LC50）的局限性2.急性毒作用帶急性毒作用帶（acuteeffectzone，Zac），即化學物急性毒性的上限與下限的比值，通常急性毒作用帶中，死亡劑量用LD50表示，最低作用劑量采用急性閾劑量（閾濃度）(Limac)表示:Zac=Z