mdr1基因多態(tài)性對(duì)度洛西汀穩(wěn)態(tài)血藥濃度的影響

mdr1基因多態(tài)性對(duì)度洛西汀穩(wěn)態(tài)血藥濃度的影響

根據(jù)近年來的藥物遺傳研究，遺傳因素是藥物代謝、轉(zhuǎn)移和靶層受體的多態(tài)性，尤其是與藥物代謝、手術(shù)和靶層受體相關(guān)的基因的多態(tài)性。可能是影響藥物臨床效果和副作用的主要因素。而藥物治療是抑郁癥主要的治療方法,其中度洛西汀是近年才在臨床上推廣使用的新型抗抑郁藥物,且屬于選擇性5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑。研究顯示,該藥是P-糖蛋白的一個(gè)底物,可被P-糖蛋白從中樞系統(tǒng)主動(dòng)泵出,從而使藥物療效降低。因此推測(cè)編碼P-糖蛋白的多藥耐藥1(multidrugresistance1,MDR1)基因多態(tài)性可能影響度洛西汀的代謝與抗抑郁療效。已有相關(guān)研究表明人群中變異頻率較高的兩個(gè)MDR1基因位點(diǎn)G2677T和C3435T多態(tài)性與帕羅西汀抗抑郁療效無關(guān),但與度洛西汀療效的關(guān)系尚未明確。故本研究擬在抑郁癥患者中探討MDR1基因的G2677T和C3435T多態(tài)性對(duì)度洛西汀穩(wěn)態(tài)血藥濃度和臨床療效的影響。1對(duì)象和方法1.1分組和排除標(biāo)準(zhǔn)均來自于2009年4月至2010年3月廣州市精神病醫(yī)院的抑郁癥門診患者,入組標(biāo)準(zhǔn):(1)符合中國(guó)精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)第3版(CCMD-3)抑郁發(fā)作標(biāo)準(zhǔn);(2)首次發(fā)作,24項(xiàng)漢密爾頓抑郁量表(24-itemHamiltondepressionratingscale,HAMD-24)總分≥20分;(3)入組前1~2周內(nèi)未接受抗精神病藥物治療并未服用過CYP2D6抑制或誘導(dǎo)劑,6周內(nèi)未服用抗精神病緩釋制劑;(4)血尿常規(guī)、肝腎功能、心電圖等均正常。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)入組前已使用過抗抑郁藥;(2)合并明顯的軀體疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和其他精神障礙;(3)嗜煙嗜酒;(4)肝腎代謝功能異常;(5)濫用精神藥物;(6)孕婦或哺乳期婦女,因語言障礙不能按臨床試驗(yàn)方案進(jìn)行者。共入組患者131例,11例在入組后3周內(nèi)逐漸脫落,其中4例因?yàn)槲改c道反應(yīng)要求換藥,4例不愿透露原因未繼續(xù)來門診接受藥物治療,3例不愿繼續(xù)用度洛西汀治療改用其他方案。最后入組120例患者,男性48例,女性72例,年齡為18~60歲,平均(37±4.5)歲,病程從3個(gè)月至12年,平均為(3.4±1.2)年。研究得到廣州市精神病院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有的受試者或其合法監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。1.2方法1.2.1治療前評(píng)估及療效評(píng)估(1)治療方法:所有患者均接受度洛西汀膠囊(商品名:欣百達(dá),每粒60mg)足量治療8周。起始量60mgqd,3周之內(nèi)視耐受情況可調(diào)整治療劑量,最大量120mg/d。必要時(shí)睡前用藥統(tǒng)一選擇為氯羥安定2~4mg/d(120例中97例患者使用)。(2)臨床療效評(píng)估:在入組時(shí)、治療6周和8周后采用HAMD-24評(píng)估患者的病情,由第一作者本人完成評(píng)估。療效判定:治療后HAMD-24的減分率<25%為無效,≥25%為有效,≥50%為顯效。1.2.2質(zhì)譜條件的確定入組時(shí)、8周末采集患者靜脈血10mL,EDTA抗凝,置于4℃保存。檢測(cè)血藥濃度的同時(shí)檢查血常規(guī)、肝功能、心電圖。應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)統(tǒng)一分析血液中度洛西汀的濃度。樣品處理:0.5mL血漿加入0.1mL0.1moL/L的NaOH溶液,振蕩1min,加入5mL乙醚,漩渦振蕩5min,取4mL上層清液,在常溫下用氮?dú)獯蹈?殘?jiān)?0uL流動(dòng)相溶解。色譜條件:色譜柱為NUCLEODURC18(2.0mm×125mm,3μm),柱溫50℃。流動(dòng)相為水(甲酸:2.7mmoL/L;醋酸銨:10mmoL/L)-乙睛(53:47,v/v),流速0.16mL/min,進(jìn)樣量5μL。質(zhì)譜條件:電離源為電噴霧電離源正源(ESI+),選擇性的監(jiān)測(cè)質(zhì)荷比(M/Z)298(度洛西汀)、286(內(nèi)標(biāo))帶正電荷的準(zhǔn)分子離子峰。毛細(xì)管電噴霧電壓3.9kV,萃取錐孔電壓1V,取樣錐孔電壓35V,電離源溫度為130℃,去溶劑溫度為200℃,去溶劑氣流速為350L/h。度洛西汀血漿濃度在1~100ng/mL內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好,萃取回收率和方法回收率均大于80%,日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于15%。1.2.3pcr擴(kuò)增和回復(fù)突變?cè)囼?yàn)利用上述靜脈血標(biāo)本分離出白細(xì)胞,并抽提DNA。參考文獻(xiàn)采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)]和限制性內(nèi)切片段多態(tài)性(RFLP)方法分析MDR1基因G2677T和C3435T位點(diǎn)的多態(tài)性。引物均由上海invitrogen公司合成。G2677T位點(diǎn)的上游引物:5′TGCAGGCTATAGGTTCCAGGCT3′,下游引物:5′TTTAGTTTGACTCACCTTCCCG3′。PCR反應(yīng)條件為:94℃2min,94℃1min,50℃1min,72℃1min,40個(gè)循環(huán),最后再72℃延伸5min,4℃終止。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為224bp,將PCR產(chǎn)物5μL加入限制性內(nèi)切酶BanI(中國(guó)大連Takara公司生產(chǎn))0.5μL混勻,37℃溫育4h,2%瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物。GG型的PCR產(chǎn)物兩條鏈均含有限制性內(nèi)切酶BanI的酶切位點(diǎn),被切開為198bp和26bp兩個(gè)片段;CT型只有一條鏈被切開,顯示出224bp和198bp片段;TT型的兩條鏈均沒有酶切位點(diǎn),仍為224bp片段。T3435C位點(diǎn)的上下游引物分別為:5′TGTTTTCAGCTGCTT-GATGG3′,5′AAGGCATGTATGTTGGCCTC3′。反應(yīng)條件為:94℃2min,94℃1min,56℃1min,72℃1min,40個(gè)循環(huán),最后再72℃延伸5min,4℃終止。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為197bp,5μL產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶Sau3AI(中國(guó)大連Takara公司生產(chǎn))0.5μL,37℃溫育4h,2%瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物。CC型PCR產(chǎn)物兩條鏈均含有Sau3AI的酶切位點(diǎn),被切開為158bp和39bp兩個(gè)片段;CT型只有一條鏈被切開,顯示197bp和158bp兩條片段;TT型的產(chǎn)物沒有酶切位點(diǎn),仍為197bp片段。見圖1。1.3berg平衡、療效評(píng)價(jià)及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以SPSS13.0進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析,各基因位點(diǎn)是否符合Hardy-Weinberg平衡采用2檢驗(yàn);各基因型組間的計(jì)量資料比較用方差分析(兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),若方差不齊采用GamesHowell檢驗(yàn)),而療效等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)分析(Kruskal-WallisH非參數(shù)檢驗(yàn))。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,雙側(cè)檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1基因型頻率的確定患者M(jìn)DR1基因G2677T和C3435T位點(diǎn)的基因型頻率均符合HardyWeinberg平衡。見表1。2=2.43,P=0.30;2=3.58,P=2.2不同基因型患者的穩(wěn)態(tài)血藥濃度分布G2677T和C3435T位點(diǎn)的不同基因型患者組間服用度洛西汀劑量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.96,P=0.38;F=1.15,P=0.35)。G2677位點(diǎn)中不同基因型患者組間的度洛西汀穩(wěn)態(tài)血藥濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.08,P<0.01),TT基因型患者組均高于GG型和GT型患者組(P<0.01)。在C3435T位點(diǎn)分析中,不同基因型患者組間的度洛西汀穩(wěn)態(tài)血藥濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.93,P<0.01),TT型患者組比CC型和CT型患者組高(P<0.05),見表1。2.3不同基因型患者組間的療效差異在治療第6、8周,對(duì)患者的療效采用無效、有效和顯效分級(jí)(秩次依次定義為1、2、3)評(píng)價(jià),分析MDR1各基因型與療效的相關(guān)性。結(jié)果表明,在G2677位點(diǎn)中,不同基因型患者組間第6、8周度洛西汀的療效差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=6.07,P=0.048;2=6.63,P=0.04),TT型患者組服用度洛西汀第6、8周的療效評(píng)分秩次均較GG型患者組高(P=0.01,P=0.02);在C3435T位點(diǎn)中,不同基因型患者組間第6、8周度洛西汀的療效差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=7.70,P=0.02;2=6.36,P=0.04),TT型患者組在第6、8周的療效評(píng)分平均秩次均較CC型患者組高(P=0.005,P=0.01),見表2。3mdr1基因多態(tài)性與患者臨床療效的關(guān)系MDR1基因中C3435T和G2677T位點(diǎn)在人群中變異頻率較高。G2677T的變異影響了編碼P-糖蛋白氨基酸序列的改變,即丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸,使P-糖蛋白的表達(dá)和功能發(fā)生改變。而C3435T位點(diǎn)發(fā)生同義突變,即突變發(fā)生在密碼子的第三個(gè)堿基位置(wobble位),故該密碼子突變未引起所編碼氨基酸序列變化,但突變后所編碼的P-糖蛋白在十二指腸的表達(dá)發(fā)生了變化,可影響P-糖蛋白底物的腸道吸收。本研究探討了G2677T/C3435T多態(tài)性對(duì)度洛西汀的穩(wěn)態(tài)血藥濃度和臨床療效的影響。本研究結(jié)果顯示,MDR1基因的G2677T和C3435T多態(tài)性的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡,兩位點(diǎn)各基因型的分布頻率與文獻(xiàn)報(bào)道相近,說明患者樣本的代表性良好。結(jié)果顯示,兩位點(diǎn)的TT基因型抑郁癥患者均具有較高的度洛西汀穩(wěn)態(tài)血藥濃度和較好的療效,表明MDR1基因的G2677T和C3435T多態(tài)性與度洛西汀的代謝和臨床療效相關(guān),提示MDR1基因多態(tài)性遺傳標(biāo)記可能預(yù)測(cè)抑郁癥藥物療效,作為個(gè)體化治療方案的重要依據(jù)。有研究表明,MDR1基因中C3435T和G2677T位點(diǎn)多態(tài)性能引起膜上P-糖蛋白表達(dá)差異,而P-糖蛋白表達(dá)上調(diào)與胞內(nèi)底物結(jié)合增加,發(fā)生構(gòu)型改變從而促進(jìn)抗抑郁藥的中樞外排,妨礙藥物吸收。這可能是本研究中各基因型患者組度洛西汀穩(wěn)態(tài)血藥濃度差異的原因之一。C3435T和G2677T位點(diǎn)TT基因型患者體內(nèi)P-糖蛋白表達(dá)和功能活性較低,可能促進(jìn)度洛西汀進(jìn)入中樞系統(tǒng)發(fā)揮藥效作用。亦有研究表明帕羅西汀抗抑郁療效與G2677T和C3435T多態(tài)性不相關(guān),研究結(jié)論差異的原因可能與各抗抑郁藥與P-糖蛋白的結(jié)合形式不同有關(guān)。帕羅西汀可作為P-糖蛋白的抑制劑,能直接抑制P-糖蛋白的活性,而度洛西汀作為P-糖蛋白的一個(gè)底物,需依靠其轉(zhuǎn)運(yùn)作