白頭鶴紅細(xì)胞及白細(xì)胞的檢測(cè)

白頭鶴紅細(xì)胞及白細(xì)胞的檢測(cè)

白頭鶴是世界上現(xiàn)存的15種鶴類之一。這是國(guó)家一級(jí)重要的保護(hù)野生動(dòng)物。被國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟（icu）列為易危物種，并列入cetesi附件。家禽的血細(xì)胞計(jì)數(shù)方法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用,但是家禽血細(xì)胞計(jì)數(shù)方法是否適用于白頭鶴還不清楚,白頭鶴血細(xì)胞計(jì)數(shù)的生理參考值也未建立。各種動(dòng)物的紅細(xì)胞手工計(jì)數(shù)方法均可采用稀釋法,哺乳動(dòng)物白細(xì)胞計(jì)數(shù)主要采用稀酸破壞法,家禽白細(xì)胞技術(shù)主要采用直接染色法。對(duì)白頭鶴白細(xì)胞計(jì)數(shù),本研究先采用了傳統(tǒng)的稀酸破壞紅細(xì)胞法、直接染色法,但計(jì)數(shù)效果均不理想。新建立的白細(xì)胞分離法則功的完成了對(duì)白頭鶴白細(xì)胞的計(jì)數(shù)。1材料和方法1.1超低溫離子束血細(xì)胞計(jì)數(shù)板;一次性真空采血管(肝素抗凝);23K超速低溫離心機(jī)(HERMLE);LD5-2A型低速離心機(jī);1640緩沖液;淋巴細(xì)胞分離液;肝素;胎盤藍(lán)。1.2樣本2012年6月在哈爾濱北方森林動(dòng)物園用真空采血管采集了2只白頭鶴抗凝血樣本,放入冰箱內(nèi)4℃保存,備用。1.3方法1.3.1管外余血加清加生理鹽水995μL于EP管中,用移液器吸取抗凝血5μL,擦去管外余血,輕輕加至裝有生理鹽水的EP底部,再輕吸上清液清洗槍頭3次,上下顛倒混勻?；靹蚝笥靡埔簶寣⒓t細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池中,室溫下平放3min,待細(xì)胞下沉后于顯微鏡下計(jì)數(shù)。1.3.2紅細(xì)胞計(jì)數(shù)組由于對(duì)白頭鶴白細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法還不是很成熟,所以先用雞血進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)。具體試驗(yàn)方法如下:取5mL雞抗凝血放在10mL離心管內(nèi),向其中加入等量的1640緩沖液混勻。取50mL的離心管,將10mL的人淋巴細(xì)胞分離液注入試管底部,然后將血液和1640混合液緩慢的注入,使血液和1640混合液漂浮在人淋巴細(xì)胞分離液的上面。將含有混合液的50mL離心管放入離心機(jī),3000r/min離心15min。離心后,紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血清分為3層,上層為血清,中間為白細(xì)胞,最底部為紅細(xì)胞。將血清和白細(xì)胞全部吸入到另外一個(gè)50mL的離心管中,放入離心機(jī)中,3000r/min,離心10min。離心后,棄掉所有液體,保留沉淀,向其中加入10mL淋巴細(xì)胞分離液充分混合均勻。然后吸出100μL白細(xì)胞渾濁液放入1.5mLEP管中,加入900μL的1640緩沖液混合均勻。吸取200μL的白細(xì)胞和1640混合液放入到另外一個(gè)EP管內(nèi),向其中加入等量的臺(tái)盼藍(lán),染色2min。將染色的白細(xì)胞懸液沖入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池,室溫下平放3分鐘,待細(xì)胞下后于顯微鏡下計(jì)數(shù)。用此方法,對(duì)同一樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。1.3.3白細(xì)胞計(jì)數(shù)用建立的白細(xì)胞分離計(jì)數(shù)法測(cè)定白頭鶴的白細(xì)胞數(shù),具體方法同1.3.2。1.3.4分類計(jì)數(shù)2結(jié)果與分析2.1同一樣品3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的比選對(duì)同一只雞進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),測(cè)得其白細(xì)胞數(shù)分別為26×109、23×109、27×109個(gè)·L-1,經(jīng)計(jì)算,其平均值為(25.33±2.08)×109個(gè)·L-1,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.217%。本實(shí)驗(yàn)先用家雞進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn),建立了一種禽類白細(xì)胞的測(cè)定方法。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,同一樣本3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.217%,說(shuō)明新建立的實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性很好。預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得的雞白細(xì)胞數(shù)量為25.33×109個(gè)·L-1,和以往文獻(xiàn)記載的雞的白細(xì)胞數(shù)量基本相當(dāng),進(jìn)一步驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)方法的有效性。用淋巴細(xì)胞分離液將紅細(xì)胞和白細(xì)胞分離開的方法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到禽類白細(xì)胞的相關(guān)研究中,徐先云用此方法分離了野鳥的白細(xì)胞,并對(duì)白介素-2進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)借用此技術(shù),分離了雞的白細(xì)胞,在對(duì)其染色后進(jìn)行了計(jì)數(shù),新建了一種禽類白細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法。2.2理化指標(biāo)檢測(cè)按照1.3中描述的實(shí)驗(yàn)方法,測(cè)得2只白頭鶴的平均紅細(xì)胞數(shù)是(0.415±0.134)×1012個(gè)·L-1,白細(xì)胞數(shù)是(2.84±0.58)×109個(gè)·L-1,中性粒細(xì)胞0.986×109個(gè)·L-1,嗜堿粒細(xì)胞0.345×109個(gè)·L-1,嗜酸性粒細(xì)胞0.277×109個(gè)·L-1,淋巴細(xì)胞1.233×109個(gè)·L-1。本實(shí)驗(yàn)測(cè)出的白鶴紅細(xì)胞和白細(xì)胞的數(shù)量(0.415×1012、2.84×109個(gè)·L-1),和其他鶴類相比數(shù)量偏低(見表1),需要在以后的研究中進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)進(jìn)行分析其原因。在用分離法分離白頭鶴白細(xì)胞的過(guò)程中,由于離心之后紅細(xì)胞層和白細(xì)胞層相臨,在操作的過(guò)程要避免白細(xì)胞收集的不完全或者帶有少量的紅細(xì)胞的現(xiàn)象出現(xiàn),以免影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。將分離獲得的白細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色,可使白細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)更加清晰,方便白細(xì)胞的計(jì)數(shù),減少實(shí)驗(yàn)誤差。在對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí),由于禽類的紅細(xì)胞不容易破裂,所以禽類白細(xì)胞計(jì)數(shù)不用稀酸破壞紅細(xì)胞法,而采用直接染色法。但在本次實(shí)驗(yàn)中,一直不能將白頭鶴的白細(xì)胞染色,使得無(wú)法用直接染色法對(duì)白頭鶴進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。家雞白細(xì)胞計(jì)數(shù)可以用直接染色法而白頭鶴不行的原因尚不清