發(fā)酵工程應(yīng)用實(shí)例 青霉素生產(chǎn)

青霉素生產(chǎn)青霉素青霉素（Penicillin，或音譯盤尼西林）又被稱為青霉素G、盤尼西林、配尼西林、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀。青霉素是抗菌素的一種，是指分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是由青霉菌中提煉出的抗生素。青霉素是一種高效、低毒、臨床應(yīng)用廣泛的重要抗生素?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)：菌種：產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)能力：達(dá)到30000-60000/mL一、青霉素生產(chǎn)菌生長(zhǎng)特性I期分生孢子發(fā)芽；II期菌絲繁殖；III期形成脂肪粒，積累貯藏物；IV期脂肪粒減少，形成中、小空泡；V期形成大空泡，脂肪粒消失；VI期細(xì)胞內(nèi)看不到顆粒，個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)自溶。帶放補(bǔ)料工二、青霉素生產(chǎn)流程結(jié)晶器種子罐1和2米孢子預(yù)處理罐過濾器發(fā)酵罐萃取器蒸發(fā)器工業(yè)鹽提煉工藝藝發(fā)冷凍干燥孢子瓊脂斜面酵

培養(yǎng)基制備無菌空氣冷至15℃

(1)、生產(chǎn)孢子制備斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，最適溫度25-26℃，培養(yǎng)6-8天，形成單菌落。再傳斜面，培養(yǎng)7天，形成綠色斜面孢子。

米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)7天，25℃

注意：每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定效價(jià)及雜菌情況。

(2)、種子罐培養(yǎng)工藝

一級(jí)種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。

培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等。空氣流量1：3（體積比）；充分?jǐn)嚢?00-350rpm；pH自然，溫度27±1℃,40h

二級(jí)種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10％ 培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。 通氣量1:1-1.5；攪拌250-280rpm；pH自然，25±1℃。10-14h

質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h(3)、生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝

三級(jí)罐：生產(chǎn)罐；接種量20％ 培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.

參數(shù)條件： 通氣量1：0.8-1.2；150-200r/min； 前60小時(shí):pH6.4-6.6，26℃；

60小時(shí)后:pH6.7,24℃。三、發(fā)酵培養(yǎng)與過程控制

操作方式：反復(fù)分批式發(fā)酵 發(fā)酵罐：100m3，裝料80m3.

帶放:6-10次，帶放量10％，間隔24h。 發(fā)酵周期：180-220h發(fā)酵過程需連續(xù)流加葡萄糖、硫酸銨以及前體物質(zhì)苯乙酸鹽，補(bǔ)糖率是最關(guān)鍵的控制指標(biāo)，不同時(shí)期分段控制。過程控制——補(bǔ)料分批操作控制基質(zhì)濃度

前40小時(shí)：培養(yǎng)基中的主要營(yíng)養(yǎng)物

40小時(shí)后：低速連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。 半饑餓狀態(tài)：延長(zhǎng)合成期，提高產(chǎn)量。 碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。 糖與6APA結(jié)合形成糖基-6APA，影響青霉素產(chǎn)量。a.流加碳源控制

根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。殘?zhí)?.3-0.6％左右，pH開始升高時(shí)流加糖。 葡萄糖的波動(dòng)范圍較窄，濃度過低使抗生素合成速度減慢或停止，過高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至引起自溶。

(1)培養(yǎng)基b.流加氮源控制

玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。 補(bǔ)加無機(jī)氮源：硫酸銨、氨水、尿素 氨基氮濃度：0.01-0.05%。c.鹽離子控制

無機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀等。 鐵對(duì)青霉素合成有毒，30-40ug/ml以下。罐壁涂環(huán)氧樹脂保護(hù)層。d.添加青霉素側(cè)鏈前體

時(shí)期：合成階段 種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸 毒性：抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和青霉素合成。 策略：低濃度流加 濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%

控制：保持供應(yīng)速率略大于生物合成需要。

(2).溫度控制適宜菌絲生長(zhǎng)溫度30℃，分泌青霉素25℃。20℃青霉素破壞少，周期很長(zhǎng)。需變溫控制，不同階段不同溫度。生長(zhǎng)階段:較高溫度，縮短生長(zhǎng)時(shí)間；生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制24℃(3).pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過7.0直接加酸或堿：自動(dòng)控制流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢。pH下降：補(bǔ)加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補(bǔ)加糖、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）(4).溶氧控制＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降；＜10％，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速:各階段的生長(zhǎng)和耗氧量不同。(5).消沫

天然油脂：玉米油； 化學(xué)消沫劑：泡敵。 策略：少量多次。 注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。四、

青霉素的提煉工藝過程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活；水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定，易溶于有機(jī)溶劑；水中溶解度很小，青霉素鹽很穩(wěn)定。(1)、預(yù)處理青霉素的存在部位：發(fā)酵液濃度較低：10－30Kg/m3含有大量雜質(zhì)：菌體細(xì)胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產(chǎn)物等目的：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過程。預(yù)處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白

(2)、過濾鼓式真空過濾機(jī)過濾：一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質(zhì)含量0.5-2.0%。板框式過濾機(jī)過濾：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土為助慮劑。二次濾液：澄清透明，用于提取（收率90％）(3)、溶劑萃取原理：青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而霉素鹽易溶于 萃取劑：青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白質(zhì)：加0.05-0.1%乳化劑PPB。萃?。?－3次。(4)、脫色

萃取液中添加活性炭，除去色素 過濾，除去活性炭。(5)、結(jié)晶——直接結(jié)晶加醋酸鈉－乙醇溶液反應(yīng)：得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液：得到青霉素鉀鹽。(5)、結(jié)晶——共沸蒸餾結(jié)晶萃取液，再用