細(xì)菌趨化性與降解性的關(guān)系研究

細(xì)菌趨化性與降解性的關(guān)系研究

環(huán)境異質(zhì)生物（xenobiccompohans）的積累將導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染。在過(guò)去幾十年中,科研工作者證實(shí)了環(huán)境中的大部分污染物可以被微生物降解,系統(tǒng)地研究了微生物降解污染物的基因、代謝途徑和調(diào)控手段,并且成功地將降解性微生物應(yīng)用于污染環(huán)境的生物修復(fù),使之成為一種安全、有效和無(wú)二次污染的生物修復(fù)方法。然而,微生物對(duì)環(huán)境污染物的修復(fù)能否最終實(shí)現(xiàn)不僅僅依賴于其降解能力本身,而且依賴于污染物的生物可利用性以及細(xì)菌與土著微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)能力。近幾年來(lái),科研工作者開(kāi)始關(guān)注一些能增強(qiáng)細(xì)菌生物降解效果的其它特性,細(xì)菌的趨化性(chemotaxis)與降解性之間的關(guān)系研究成為熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。1趨化性的分類細(xì)菌的趨化性是細(xì)菌響應(yīng)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)梯度的移動(dòng),這種遷移具有方向性,或順濃度梯度(正趨化),或逆濃度梯度移動(dòng)(負(fù)趨化)。在大多數(shù)情況下,趨化物(chemoattractant)能作為細(xì)菌的碳源和能源,而負(fù)趨化物(chemorepellent)則對(duì)細(xì)菌有毒害作用。根據(jù)趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式可以將趨化性廣義地分為兩類:一類是非代謝依賴趨化性(metabolism-independentchemotaxis),其主要有3個(gè)特點(diǎn):①非代謝的趨化物的同類物也是趨化物;②趨化物代謝途徑的突變不影響趨化性;③在代謝底物存在的情況下,對(duì)趨化物仍有趨化性。另一類是代謝依賴趨化性(metabolism-dependentchemotaxis),主要特點(diǎn)是:①非代謝的趨化物的同類物不是趨化物;②抑制對(duì)趨化物的代謝也就阻礙了對(duì)此趨化物的趨化性;③存在另外的代謝底物阻礙了對(duì)所有趨化物的趨化性。細(xì)菌趨化性的檢測(cè)分析方法可分為游動(dòng)平板法(Swarmplateassay)、滴定分析法(Dropassay)、瓊脂糖塞子法(Agaroseplugassay)、毛細(xì)管法(Capillaryassay)、數(shù)量分析法(Quantificationassay)等。2受體受體蛋白flagerange在自然環(huán)境中,與微環(huán)境直接相互作用的單細(xì)胞生物進(jìn)化了完善的機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境的變化,通過(guò)綜合受體蛋白感知環(huán)境信號(hào),隨后調(diào)整鞭毛運(yùn)動(dòng)方向來(lái)尋找合適的生存環(huán)境。在Escherichiacoli和Salmonellaserovar中,趨化反應(yīng)是通過(guò)兩個(gè)大分子復(fù)合體調(diào)節(jié)的,即處于細(xì)胞兩極的受體復(fù)合體(receptorcomplexs)和5～10個(gè)隨機(jī)分布于細(xì)胞四周、埋于細(xì)胞膜中的鞭毛-馬達(dá)復(fù)合體(flagellar-motorcomplexs)。負(fù)責(zé)感應(yīng)環(huán)境變化的受體復(fù)合體蛋白分為兩類:①趨化特異性的甲基接受趨化蛋白MCPs(methyl-acceptingchemotaxisproteins),包括Aer、Tar、Tsr、Trg和Tap/Tcp5個(gè)趨化特異的穿膜受體蛋白。②具有趨化和轉(zhuǎn)運(yùn)雙重功能的受體蛋白,如PtsM和PtsG蛋白。這兩類受體復(fù)合體蛋白都具有周質(zhì)空間感應(yīng)區(qū)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)信號(hào)區(qū)。在周質(zhì)空間中信號(hào)分子與感應(yīng)區(qū)的結(jié)合激發(fā)了信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖1),通過(guò)甲基酯酶(CheB)和甲基轉(zhuǎn)移酶(CheR)調(diào)節(jié)MCPs的甲基化來(lái)影響組氨酸激酶(CheA)的磷酸化,再來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(CheY)的磷酸化。CheY與鞭毛馬達(dá)開(kāi)關(guān)(Flagellamotorswith)FliM,FliN,FliG結(jié)合,CheY的磷酸化與否將直接決定鞭毛的旋轉(zhuǎn)方向。理解細(xì)菌對(duì)氨基酸等簡(jiǎn)單化合物的趨化分子機(jī)制便于深入了解細(xì)菌對(duì)自然環(huán)境中污染物的趨化反應(yīng),使人們能夠了解細(xì)菌如何感應(yīng)并游向污染物或?qū)ふ液线m的污染物濃度環(huán)境。3異生物質(zhì)的趨化性生物細(xì)菌對(duì)許多化合物都具有趨化性,這可能是細(xì)菌為尋找碳源和能源而進(jìn)化出的一種選擇優(yōu)勢(shì)。在地球生命剛剛起源的時(shí)候,地球上生命形式很少,存在充足的碳源和能源,簡(jiǎn)單細(xì)胞幾乎沒(méi)有行為反應(yīng)。隨著生命進(jìn)化歷程的推移,生命形式的大量出現(xiàn)導(dǎo)致了細(xì)胞對(duì)碳源和能源的競(jìng)爭(zhēng),細(xì)胞隨之進(jìn)化了趨氧、趨光、趨化等一系列行為反應(yīng)。當(dāng)環(huán)境中大量異生物質(zhì)存在時(shí),細(xì)菌細(xì)胞便進(jìn)化了伴隨著趨化性的對(duì)污染物的降解性能。最近幾十年間,科研工作者關(guān)于細(xì)菌對(duì)環(huán)境污染物的趨化性研究產(chǎn)生了極大興趣,分離、鑒定了大量對(duì)環(huán)境異生物質(zhì)具有趨化性的微生物(表1),其中包括Pseudomonas、Azospirillum、Ralstonia、Agrobacterium和Bradyrhizobium等菌屬。污染趨化物種類繁多,從結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的芳香族化合物到復(fù)雜的氯代、硝基芳香族化合物,包含了大部分的有機(jī)環(huán)境污染物。從表1中可以看出,大部分趨化物可以被細(xì)菌降解。Sanmata等人研究了Ralstoniasp.SJ98對(duì)p-硝基苯酚、4-硝基鄰苯二酚、o-硝基苯甲酸和p-硝基苯甲酸的降解及趨化性,結(jié)果表明該菌株只對(duì)能降解的硝基芳香族化合物NACs(nitroaromaticcompounds)有趨化性,而對(duì)不能降解的NACs則無(wú)趨化性。越來(lái)越多的證據(jù)顯示,可以游動(dòng)的微生物對(duì)其可降解的環(huán)境污染物幾乎都具有趨化性,這種細(xì)菌的趨化性與降解性之間的緊密聯(lián)系暗示了趨化性很可能是降解性的重要屬性之一。4基于于甲苯和4-羥基苯甲酸細(xì)菌趨化性與降解性的緊密關(guān)聯(lián)已經(jīng)從細(xì)菌對(duì)其大多降解底物具有趨化性的表觀現(xiàn)象中初步得到證實(shí),然而許多學(xué)者希望從分子生物學(xué)水平尋找直接的證據(jù)來(lái)證明這一點(diǎn)。介于甲苯和4-羥基苯甲酸是地球圈內(nèi)廣泛存在的簡(jiǎn)單芳香族污染物;萘是美國(guó)環(huán)保局列出的優(yōu)先控制污染物,是多環(huán)芳烴污染物生物降解研究的模式化合物;2,4-D是廣泛應(yīng)用的氯代芳香族化合物除草劑,為美國(guó)環(huán)境規(guī)劃署列出的潛在的持久性有機(jī)污染物(POPs),科研工作者對(duì)這些從結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單到復(fù)雜的化合污染物的生物降解特性和趨化性進(jìn)行了大量的研究,目前取得了一些進(jìn)展,并克隆和分析了與降解基因共轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的趨化相關(guān)基因,本文將以這些化合物為代表闡明趨化性與降解性之間關(guān)系的分子機(jī)制。4.1雙組分感應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)Parales等人研究發(fā)現(xiàn)P.putidaF1對(duì)苯、甲苯、乙基苯、丙基苯、三氯乙烯(TCE)、α,α,α-三氟甲苯(TFT)、cis-1,2-二氯乙烯(DCE)和四氯乙烯(PCE)等芳香族和氯代芳香族化合物有強(qiáng)烈的趨化性,而且上述化合物都是甲苯雙加氧酶的底物。P.putidaF1能通過(guò)間位開(kāi)環(huán)途徑完全降解甲苯。位于染色體上的甲苯降解基因簇todXFC1C2BADEGIH已經(jīng)克隆并測(cè)序,上游相鄰的是編碼p-異丙基苯和p-香豆酸的降解基因,編碼誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的雙組分感應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-componentsensorytransductionsystem)的todS和todT兩個(gè)基因緊隨降解結(jié)構(gòu)基因之后(圖2A),它們都位于一個(gè)轉(zhuǎn)座子上。Parales又發(fā)現(xiàn)todX、todC1、todC2和todD等降解關(guān)鍵基因的突變嚴(yán)重影響對(duì)甲苯的降解,但不影響對(duì)甲苯的趨化反應(yīng)。todS和todT基因的突變阻礙了菌株以甲苯為底物的生長(zhǎng),而且使菌株喪失了對(duì)甲苯的趨化反應(yīng),表明在甲苯存在的情況下,負(fù)責(zé)趨化的相關(guān)基因與降解基因是受todS和todT協(xié)同調(diào)節(jié)的。todS蛋白可能激發(fā)了趨化感應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),可能是趨化受體蛋白。4.24表達(dá)4-羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Harwood等人發(fā)現(xiàn)了P.putidaPRS2000中染色體編碼的4-羥基苯甲酸降解基因與趨化基因是被共同調(diào)節(jié)的(圖2B)。他們從趨化突變子中克隆到了一個(gè)pac基因簇,pcaBDC編碼4-羥基苯甲酸降解基因,pcaRFK編碼調(diào)節(jié)蛋白(PcaR)、β-酮己二酸單酰輔酶A(PcaF)以及4-羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PcaK)。PcaK的分子量大約為47kDa,在氨基酸水平上與許多膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有20%～25%的同源性,實(shí)驗(yàn)證明該蛋白不僅有轉(zhuǎn)運(yùn)4-羥基苯甲酸的功能,而且對(duì)細(xì)菌的趨化性有重要作用。pcaK基因的突變導(dǎo)致了菌株對(duì)4-羥基苯甲酸和苯甲酸趨化性的喪失,證實(shí)PcaK蛋白是細(xì)菌趨化性所必需的,是趨化受體蛋白。同樣,在A.calcoaceticus中也克隆到一個(gè)降解4-羥基苯甲酸基因簇pcaIJFBDKCHG(圖2C),其中負(fù)責(zé)芳香族化合物轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白PcaK與Harwood報(bào)道的趨化受體蛋白在氨基酸水平上有57%的相似性,推測(cè)PcaK蛋白既是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白又是趨化受體蛋白。4.3nah7質(zhì)粒及酶基因的趨化性菌株P(guān).putidaG7和P.putidaNCIB9816-4中萘降解基因分別是由83kb的自主轉(zhuǎn)移大質(zhì)粒NAH7和質(zhì)粒pDTG1編碼的(圖2D、E)。為了研究這兩株菌株對(duì)萘的趨化性是否與質(zhì)粒有關(guān),Grimm等人發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的改造使這兩株菌株均喪失了原本對(duì)萘的趨化性,說(shuō)明萘的趨化基因與降解基因都位于質(zhì)粒上。他們從NAH7質(zhì)粒上亞克隆了除nahK、nahM和nahO外的所有萘降解基因的25kb的EcoRI片段,該片段編碼降解萘和水楊酸為4-草酰巴豆酸的酶基因,但卻無(wú)法恢復(fù)菌株對(duì)萘的趨化性,表明編碼趨化受體蛋白或調(diào)節(jié)蛋白的趨化基因可能位于降解基因之外的NAH7質(zhì)粒其他部位。Grimm和Harwood進(jìn)一步亞克隆了一個(gè)緊鄰25kb片段下游的5.9kb的片段(圖2D),該片段包含萘鄰位開(kāi)環(huán)下游降解基因nahOMKJ和nahXY。nahY基因編碼了538個(gè)氨基酸,與P.aeruginosa中趨化相關(guān)的膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PctB在氨基酸水平上有28%的相似性,375至425位氨基酸殘基與E.coli和S.serovar中高度保守的趨化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的趨化信號(hào)區(qū)有70%的相似性。nahY蛋白有兩個(gè)保守的與MCPs相似的特征區(qū),即兩個(gè)膜展區(qū)(membrane-spanningregion)。nahY基因3’保守末端的突變導(dǎo)致了菌株對(duì)萘的趨化性的喪失,推測(cè)NahY蛋白為萘的趨化受體蛋白,是通過(guò)在周質(zhì)空間與萘結(jié)合激發(fā)了類似于E.coli和S.serovar中趨化化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生。RT-PCR顯示了nahJ、nahX和nahY是共轉(zhuǎn)錄的,位于一個(gè)操縱子中,這一結(jié)果表明趨化性是降解性的一個(gè)重要屬性,即質(zhì)粒編碼的趨化受體蛋白與宿主鞭毛運(yùn)動(dòng)蛋白相互作用,使細(xì)胞游向底物并利用質(zhì)粒上位于一個(gè)操縱元中基因編碼的酶將其降解。Samanta同樣也證實(shí)了萘降解菌P.putidaRKJ1中的83kb質(zhì)粒的25kb的EcoRI片段編碼了萘的降解基因和趨化基因,并且證實(shí)了萘的降解是趨化所必需的,伴隨著萘降解產(chǎn)生的能量流激發(fā)了趨化反應(yīng)的發(fā)生。4.42tf客體趨化性基因型的檢測(cè)菌株R.eutrophaJMP134中含有自主轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒pJP4編碼了兩套獨(dú)立的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的降解基因簇tfd和tfdⅡ(圖2F)。Hawkins等人發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)2,4-D的趨化基因也是由該質(zhì)粒編碼的。改造pJP4質(zhì)粒導(dǎo)致菌株喪失了趨化性,并發(fā)現(xiàn)tfdK基因?yàn)橼吇匦璧?且與降解基因是協(xié)同調(diào)節(jié)的。該菌株對(duì)2,4-D的降解性與趨化性的緊密相關(guān)暗示了趨化性是2,4-D降解過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié),降解基因誘導(dǎo)了趨化基因的表達(dá)。tfdK基因編碼的TfdK滲透酶含有12個(gè)膜展區(qū),該酶催化了2,4-D向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),它與P.putidaPRS2000中的PcaK蛋白在氨基酸水平上有33%的相似性,然而與一般的MCP蛋白卻無(wú)相似性,可能是第2個(gè)具有轉(zhuǎn)運(yùn)和趨化功能的超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(majorfacilitatorsuperfamilytransportprotein)。從基因水平的角度證明降解基因與趨化基因相鄰或位于一個(gè)基因簇中,甚至是共轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),有力地證明了降解性與趨化性之間的相關(guān)性,但負(fù)趨化反應(yīng)的分子機(jī)制至今還沒(méi)有被完全闡明,有人認(rèn)為正、負(fù)趨化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)在E.coli中不一定是獨(dú)立的,而很有可能最終是一體的。5生物修復(fù)工程細(xì)菌趨化性在污染物的生物修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮的主要作用表現(xiàn)在:①趨化性可以使降解菌株與污染物緊密接觸,解決污染物的生物可利用性問(wèn)題。生物修復(fù)的第一步是細(xì)菌和污染物之間的接觸,趨化性可以使細(xì)菌有效地感應(yīng)并游向污染物,克服了異位生物修復(fù)中需要大量轉(zhuǎn)移污染物的缺陷。另一方面,環(huán)境中的一些污染物水溶性極低,常常吸附于固體顆粒表面或溶于非水相液體(nonaqueous-phaseliquid,NAPL)中,而只有當(dāng)目標(biāo)污染物存在于水相時(shí),生物降解反應(yīng)才更易發(fā)生。生物降解反應(yīng)速率往往受限于污染物從非水相向水相轉(zhuǎn)移的速率,因此,要想對(duì)此類難修復(fù)污染物取得好的生物修復(fù)效果,細(xì)菌必須具有溶解污染物于水相或直接粘附于NAPL界面的能力,而趨化性細(xì)菌可以有效地感應(yīng)到污染物,增加污染物周圍的細(xì)菌濃度,促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)或通過(guò)生物膜的形成來(lái)提高化合物的生物可利用性和生物降解性。②趨化性使降解性細(xì)菌與土著微生物的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)中表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。在有限的碳源和能源環(huán)境中,降解性微生物與土著微生物之間存在著營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,細(xì)菌的趨化性可以增加細(xì)菌尋找合適碳源、氮源和能源的機(jī)會(huì),使細(xì)菌在低濃度底物的自然環(huán)境中具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),能利用存在于土壤、沉積物和根際中的低濃度污染化合物作為碳源和能源生長(zhǎng),這對(duì)于低濃度污染物廣泛分布區(qū)域的生物修復(fù)尤為重要。③趨化性促進(jìn)自主轉(zhuǎn)移性代謝質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。一些菌株中降解基因與趨化性基因緊密相連,而這些基因又與移動(dòng)基因元件(MobileGeneticElements,MGEs)共同構(gòu)成代謝轉(zhuǎn)座子(圖2D、E、F)。在污染環(huán)境中,趨化性使細(xì)菌在污染物周圍聚集,各種降解細(xì)菌互相接觸,促進(jìn)了代謝轉(zhuǎn)座子的水平轉(zhuǎn)移,使降解基因向土著微生物或其它降解菌中轉(zhuǎn)移分布,形成新的代謝途徑,使細(xì)菌群落能更快的適應(yīng)污染環(huán)境,從而增強(qiáng)生物修復(fù)效果。Witt等最早在實(shí)驗(yàn)室微宇宙系統(tǒng)中研究發(fā)現(xiàn)趨化性能促進(jìn)細(xì)菌對(duì)沉積物中四氯甲烷污染物的生物修復(fù)。有人還研究了菌株P(guān).putidaG4、P.putidaKR1和P.putidaF1消除TCE、苯、苯酚和p-二甲苯混合物的盆缽和小區(qū)試驗(yàn),結(jié)果表明細(xì)菌的趨化性可以加速環(huán)境污染物的生物降解。Marx和Aitken在水系統(tǒng)中評(píng)價(jià)了P.putidaG7的趨化性在萘降解過(guò)程中作用。通過(guò)比較野生菌株、趨化突變菌株和非游動(dòng)菌株對(duì)萘的降解,他們發(fā)現(xiàn)野生菌株的降解速率要比其它兩株菌株快。如果要同樣達(dá)到相同的降解效果,趨化突變株的細(xì)胞濃度要比野生菌株高出幾倍。Law等人又研究了P.putidaG7在非水相體系中趨化性對(duì)萘的遷移和降解的影響。他們將萘溶于典型的NAPL2,2,4,4,6,8,8-七甲基壬烷(HMN)中,研究結(jié)果表明野生型的P.putidaG7菌株比非趨化性和趨化突變株更能在HMN表面聚集,降解水相一側(cè)萘的濃度,使界面兩側(cè)萘的濃度梯度加劇,促使萘從非水相向水相一側(cè)遷移,并最終促進(jìn)萘的降解。Pedit同樣證實(shí)了非趨化性菌株要達(dá)到趨化性菌株對(duì)萘相同的降解效果時(shí),其數(shù)量也須高出幾倍。Bhushan等首次報(bào)道了Clostridiumsp.EDB2對(duì)疏水性的環(huán)硝基胺類炸藥污染物的生物降解是由趨化性介導(dǎo)的。1,3,5-三硝基均苯(RDX)降解產(chǎn)生的NO-2是菌株Clostridiumsp.EDB2的趨化物,在環(huán)境中,環(huán)硝基胺類污染物的降解產(chǎn)生的NO-2吸引了遠(yuǎn)處降解菌的加入,提高降解細(xì)菌的濃度,增加了生物降解效果,證實(shí)趨化性在環(huán)硝基胺類污染物的生物修復(fù)過(guò)程有重要作用。Lanfranconi從汽油污染的土壤中分離到一株脂肪烴降解菌Flavimonasoryzihabitans,該菌對(duì)分離地土壤中存在的十六烷烴等鏈烷烴具有趨化性,結(jié)果表