發(fā)酵工程04第四章 發(fā)酵機制

第四章微生物的代謝機制新陳代謝（metabolism）是指發(fā)生在活細胞中的各種分解代謝（catabolism）和合成代謝（anabolism）的總和即：新陳代謝=分解代謝+合成代謝分解代謝是指復雜的有機物分子通過分解代謝酶系的催化，產(chǎn)生簡單分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和還原力（或稱還原當量，一般用[H]來表示）的作用。合成代謝與分解代謝正好相反，是指在合成代謝酶系的催化下，由簡單小分子、ATP形式的能量和[H]形式的還原力一起合成復雜的大分子的過程。分解代謝與合成代謝的含義及其間的關(guān)系可簡單地表示為：第一節(jié)

微生物的能量代謝

能量代謝的中心任務(wù)，是生物體如何把外界環(huán)境中多種形式的最初能源轉(zhuǎn)換成對一切生命活動都能使用的通用能源——ATP。一、化能異養(yǎng)微生物的生物氧化和產(chǎn)能

生物氧化就是發(fā)生在活細胞內(nèi)的一系列產(chǎn)能性氧化反應(yīng)的總稱。

生物氧化與非生物氧化即燃燒相同點是它們的總效應(yīng)都是通過有機物的氧化反應(yīng)而釋放出其中的化學潛能。

生物氧化生物氧化的形式包括某物質(zhì)與氧結(jié)合、脫氫或失去電子三種；生物氧化的過程可分脫氫（或電子）、遞氫（或電子）和受氫（或電子）三個階段；生物氧化的功能則有產(chǎn)能（ATP）、產(chǎn)還原力[H]和產(chǎn)小分子中間代謝物三種。

（一）底物脫氫的四條主要途徑

HMP途徑在微生物生命活動中有著極其重要的意義（1）為核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖-磷酸。（2）產(chǎn)生大量的NADPH2形式的還原劑，它不僅為合成脂肪酸、固醇等重要細胞物質(zhì)之需，而且可通過呼吸鏈產(chǎn)生大量能量，這些都是EMP途徑和TCA循環(huán)所無法完成的。（3）如果微生物對戊糖的需要超過HMP途徑的正常供應(yīng)量時，可通過EMP途徑與本途徑在果糖-1，6-二磷酸和甘油醛-3-磷酸處的連接來加以調(diào)劑。（4）反應(yīng)中的赤蘚糖-4-磷酸可用于合成芳香氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸。（5）由于在反應(yīng)中存在著C3～C7的各種糖，使具有HMP途徑的微生物的碳源利用范圍更廣，例如它們可以利用戊糖作碳源。（6）通過本途徑而產(chǎn)生的重要發(fā)酵產(chǎn)物很多，例如核苷酸、若干氨基酸、輔酶和乳酸（異型乳酸發(fā)酵）等。利用Z.mobilis等細菌以生產(chǎn)酒精，是近年來正在開發(fā)的工業(yè)，它比傳統(tǒng)的酵母酒精發(fā)酵有許多優(yōu)點：（1）代謝速率高（2）產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高（3）菌體生成少（4）代謝副產(chǎn)物少（5）發(fā)酵溫度較高（6）不必定期供氧等。細菌酒精發(fā)酵也有其缺點，主要是其生長PH為5，較易染菌（而酵母菌為pH3），其次是細菌耐乙醇力較酵母菌為低（前者約為7.0％，后者則為8～10％）。

（二）遞氫和受氫

在生物體中，貯存在葡萄糖等有機物中的化學能，經(jīng)上述的多種途徑脫氫后，經(jīng)過呼吸鏈（或稱電子傳遞鏈）等方式進行遞氫，最終與受氫體（氧、無機或有機氧化物）結(jié)合，以釋放其化學潛能。根據(jù)遞氫特別是受氫過程中氫受體性質(zhì)的不同，可以把生物氧化區(qū)分成呼吸（有氧呼吸）、無氧呼吸和發(fā)酵三種類型

1．呼吸是一種最普遍和最重要的生物氧化方式，其特點是底物按常規(guī)方式脫氫后，經(jīng)完整的呼吸鏈遞氫，最終由分子氧接受氫并產(chǎn)生水和釋放能量（ATP）。由于呼吸必須在有氧條件下進行，因此又稱有氧呼吸。2．無氧呼吸，又稱厭氧呼吸，是一類呼吸鏈末端的氫受體為外源無機氧化物（個別為有機氧化物）的生物氧化。這是一類在無氧條件下進行的產(chǎn)能效率較低的特殊呼吸。其特點是底物按常規(guī)途徑脫氫后，經(jīng)部分呼吸鏈遞氫，最終由氧化態(tài)的無機物（個別是有機物延胡索酸）受氫。（1）硝酸鹽呼吸

又稱反硝化作用。硝酸鹽在微生物生命活動中具有兩種功能，其一是在有氧或無氧條件下所進行的同化性硝酸鹽還原作用，亦即微生物利用硝酸鹽作為其氮源營養(yǎng)物的作用；其二是在無氧條件下，微生物利用硝酸鹽作為呼吸鏈的最終氫受體，這是一種異化性的硝酸鹽還原作用。共同特點是硝酸鹽都要經(jīng)過一種含鉬的硝酸鹽還原酶將其還原為亞硝酸。硫酸鹽呼吸是一種由硫酸鹽還原細菌（或稱反硫化細菌）把經(jīng)呼吸鏈傳遞的氫交給硫酸鹽這類末端氫受體的一種厭氧呼吸。這是一種異化性的硫酸鹽還原作用。通過這一過程，微生物就可在無氧條件下借呼吸鏈的電子傳遞磷酸化而獲得能量。硫酸鹽還原的最終產(chǎn)物是H2S，自然界中的大多數(shù)H2S是由這一反應(yīng)產(chǎn)生的。與硝酸鹽還原細菌不同的是，硫酸鹽還原細菌都是一些嚴格依賴于無氧環(huán)境的專性厭氧細菌。

（4）碳酸鹽呼吸是一類以CO2或重碳酸鹽作為無氧呼吸鏈的末端氫受體的無氧呼吸。根據(jù)其還原產(chǎn)物的不同，可分為兩種類型，一類是產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生甲烷的碳酸鹽呼吸，另一類為產(chǎn)乙酸細菌產(chǎn)生乙酸的碳酸鹽呼吸。3．發(fā)酵：在生物氧化或能量代謝中，發(fā)酵僅是指在無氧條件下，底物脫氫后所產(chǎn)生的還原力[H]不經(jīng)過呼吸鏈傳遞而直接交給某一內(nèi)源氧化性中間代謝產(chǎn)物的一類低效產(chǎn)能反應(yīng)。異型乳酸發(fā)酵第二節(jié)分解代謝和合成代謝間的聯(lián)系

分解代謝的功能在于保證正常合成代謝的進行，而合成代謝又反過來為分解代謝創(chuàng)造了更好的條件，兩者相互聯(lián)系，促進了生物個體的生長繁殖和種族的繁榮發(fā)展。中間代謝產(chǎn)物的重要性如果在生物體中只進行能量代謝，則有機能源的最終結(jié)局只是產(chǎn)生ATP、H2O和CO2，這時便沒有任何中間代謝物可供累積，因此，合成代謝也不可能正常進行。相反，如果要進行正常的合成代謝，又須抽走大量為分解代謝正常進行所必需的中間代謝物，結(jié)果也勢必影響具有循環(huán)機制的分解代謝的正常運轉(zhuǎn)。一、兼用代謝途徑凡在分解代謝和合成代謝中具有雙重功能的途徑，就稱兼用代謝途徑。EMP、HMP和TCA循環(huán)是重要的兼用代謝途徑。①在兼用代謝途徑中，合成途徑并非分解途徑的完全逆轉(zhuǎn)。②在分解與合成代謝途徑中，在相應(yīng)的代謝步驟中，往往還包含了完全不同的中間代謝物。③在真核生物中，合成代謝和分解代謝一般在細胞的不同區(qū)域中分隔進行，原核生物因其細胞結(jié)構(gòu)上的間隔程度低，故反應(yīng)的控制主要在簡單的酶分子水平上進行。二、代謝物回補順序

所謂回補順序，又稱補償途徑或添補途徑，就是指能補充兼用代謝途徑中因合成代謝而消耗的中間代謝物的反應(yīng)。這樣，當重要產(chǎn)能途徑中的關(guān)鍵中間代謝物必須被大量用作生物合成的原料時，仍可保證能量代謝的正常進行。第三節(jié)微生物的代謝調(diào)控與發(fā)酵生產(chǎn)

微生物有著一整套可塑性極強和極精確的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，以保證上千種酶能正確無誤、有條不紊地進行極其復雜的新陳代謝反應(yīng)。微生物細胞的代謝調(diào)節(jié)方式：可調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)透過細胞膜而進入細胞的能力；通過酶的定位以限制它與相應(yīng)底物的接近；調(diào)節(jié)代謝流。其中以調(diào)節(jié)代謝流的方式最為重要，它包括兩個方面，一是“粗調(diào)”，即調(diào)節(jié)酶的合成量，二是“細調(diào)”，即調(diào)節(jié)現(xiàn)成酶分子的催化活力，兩者往往密切配合和協(xié)調(diào)，以達到最佳調(diào)節(jié)效果。利用微生物代謝調(diào)控能力的自然缺損或通過人為方法獲得突破代謝調(diào)控的變異菌株，可為發(fā)酵工業(yè)提供生產(chǎn)有關(guān)代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株。一、酶活性的調(diào)節(jié)

酶活性的調(diào)節(jié)是指在酶分子水平上的一種代謝調(diào)節(jié)，它是通過改變現(xiàn)成的酶分子活性來調(diào)節(jié)新陳代謝的速率，包括酶活性的激活和抑制兩個方面。酶活性的激活系指在分解代謝途徑中，后面的反應(yīng)可被較前面的中間產(chǎn)物所促進。

一條代謝途徑的終產(chǎn)物，有時可與該代謝途徑的第一步反應(yīng)的酶相結(jié)合，結(jié)合的結(jié)果使這個酶活性下降，從而使整條代謝途徑的反應(yīng)速度慢起來。這種情況稱為“反饋抑制”。值得注意的是，發(fā)生反饋抑制時，代謝終產(chǎn)物與酶結(jié)合時，是非共價結(jié)合，是可逆的。酶活性的抑制主要是反饋抑制，它主要表現(xiàn)在某代謝途徑的末端產(chǎn)物（即終產(chǎn)物）過量時，這個產(chǎn)物可反過來直接抑制該途徑中第一個酶的活性，促使整個反應(yīng)過程減慢或停止，從而避免了末端產(chǎn)物的過多累積。4、酶的活性可以調(diào)控

在代謝途徑中調(diào)節(jié)酶活性幾個酶或十幾個酶前后配合，完成一系列代謝反應(yīng)，形成一條代謝途徑。在一條代謝途徑中，常常是前一個酶促反應(yīng)的底物，便是下一個酶促反應(yīng)的底物。返回第一個酶（有活性）第一個酶（無活性）終產(chǎn)物終產(chǎn)物（調(diào)節(jié)物）結(jié)合在調(diào)節(jié)中心

共價調(diào)節(jié)

有時候，酶蛋白分子可以和一個基團形成共價結(jié)合，結(jié)合的結(jié)果，使酶蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使酶活性發(fā)生改變。例如，與磷酸根的結(jié)合。這種調(diào)節(jié)酶活性的情況稱為酶的共價調(diào)節(jié)。返回糖元磷酸化酶有磷酸化位點

競爭性抑制

有的酶在遇到一些化學結(jié)構(gòu)與底物相似的分子時，這些分子與底物競爭結(jié)合酶的活性中心，亦會表現(xiàn)出酶活性的降低（抑制）。這種情況稱為酶的競爭性抑制。競爭性抑制劑在結(jié)構(gòu)上與底物相似（一）反饋抑制的類型

1．直線式代謝途徑中的反饋抑制2．分支代謝途徑中的反饋抑制。在分支代謝途徑中，反饋抑制的情況較為復雜。為避免在一個分支上的產(chǎn)物過多時不致同時影響另一分支上產(chǎn)物的供應(yīng)，微生物已發(fā)展出多種調(diào)節(jié)方式。（1）同功酶調(diào)節(jié)同功酶是指能催化相同的生化反應(yīng)，但酶蛋白分子結(jié)構(gòu)有差異的一類酶，它們雖同存于一個個體或同一組織中，但在生理、免疫和理化特性上卻存在著差別。同功酶的主要功能在于其代謝調(diào)節(jié)。在一個分支代謝途徑中，如果在分支點以前的一個較早的反應(yīng)是由幾個同功酶所催化時，則分支代謝的幾個最終產(chǎn)物往往分別對這幾個同功酶發(fā)生抑制作用。（2）協(xié)同反饋抑制：指分支代謝途徑中的幾個末端產(chǎn)物同時過量時才能抑制共同途徑中的第一個酶的一種反饋調(diào)節(jié)方式。（3）合作反饋抑制：系指兩種末端產(chǎn)物同時存在時，可以起著比一種末端產(chǎn)物大得多的反饋抑制作用。（4）累積反饋抑制：每一分支途徑的末端產(chǎn)物按一定百分率單獨抑制共同途徑中前面的酶，所以當幾種末端產(chǎn)物共同存在時，它們的抑制作用是累積的。（5）順序反饋抑制：當E過多時，可抑制C→D，這時由于C的濃度過大而促使反應(yīng)向F、G方向進行，結(jié)果又造成了另一末端產(chǎn)物G濃度的增高。由于G過多就抑制了C→F，結(jié)果造成C的濃度進一步增高。C過多又對A→B間的酶發(fā)生抑制，從而達到了反饋抑制的效果。這種通過逐步有順序的方式達到的調(diào)節(jié)，稱為順序反饋抑制二、酶合成的調(diào)節(jié)

酶合成的調(diào)節(jié)是一種通過調(diào)節(jié)酶的合成量進而調(diào)節(jié)代謝速率的調(diào)節(jié)機制，這是一種在基因水平上（在原核生物中主要在轉(zhuǎn)錄水平上）的代謝調(diào)節(jié)。凡能促進酶生物合成的現(xiàn)象，稱為誘導。能阻礙酶生物合成的現(xiàn)象，則稱為阻遏。與上述調(diào)節(jié)酶活性的反饋抑制等相比，調(diào)節(jié)酶的合成（即產(chǎn)酶量）而實現(xiàn)代謝調(diào)節(jié)的方式是一類較間接而緩慢的調(diào)節(jié)方式。其優(yōu)點則是通過阻止酶的過量合成，有利于節(jié)約生物合成的原料和能量。在正常代謝途徑中，酶活性調(diào)節(jié)和酶合成調(diào)節(jié)兩者是同時存在且密切配合、協(xié)調(diào)進行的。（一）酶合成調(diào)節(jié)的類型

1．誘導根據(jù)酶的生成是否與環(huán)境中所存在的該酶底物或其有關(guān)物的關(guān)系，可把酶劃分成組成酶和誘導酶兩類。

誘導酶是細胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時合成的一類酶。能促進誘導酶產(chǎn)生的物質(zhì)稱為誘導物，它可以是該酶的底物，也可以是難以代謝的底物類似物或是底物的前體物質(zhì)。

酶的誘導合成類型同時誘導：即當誘導物加入后，微生物能同時或幾乎同時誘導幾種酶的合成，它主要存在于短的代謝途徑中。例如，將乳糖加入到E．coli培養(yǎng)基中后，即可同時誘導出β-半乳糖苷透性酶、β-半乳糖苷酶和半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶的合成；順序誘導：即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中間代謝物的酶，以達到對較復雜代謝途徑的分段調(diào)節(jié)。2．阻遏在微生物的代謝過程中，當代謝途徑中某末端產(chǎn)物過量時，除可用前述的反饋抑制的方式來抑制該途徑中關(guān)鍵酶的活性以減少末端產(chǎn)物的生成外，還可通過阻遏作用來阻礙代謝途徑中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的一系列酶的生物合成，從而更徹底地控制代謝和減少末端產(chǎn)物的合成。阻遏作用有利于生物體節(jié)省有限的養(yǎng)料和能量。阻遏的類型主要有末端代謝產(chǎn)物阻遏和分解代謝產(chǎn)物阻遏兩種。（1）末端產(chǎn)物阻遏指由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積而引起的阻遏。對直線式反應(yīng)途徑來說，末端產(chǎn)物阻遏的情況較為簡單，即產(chǎn)物作用于代謝途徑中的各種酶，使之合成受阻遏。對分支代謝途徑來說，情況就較復雜。每種末端產(chǎn)物僅專一地阻遏合成它的那條分支途徑的酶。代謝途徑分支點以前的“公共酶”僅受所有分支途徑末端產(chǎn)物的阻遏，此即稱多價阻遏作用。末端產(chǎn)物阻遏在代謝調(diào)節(jié)中有著重要的作用，它可保證細胞內(nèi)各種物質(zhì)維持適當?shù)臐舛取＃?）分解代謝物阻遏指細胞內(nèi)同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。因此，分解代謝物的阻遏作用，就是指代謝反應(yīng)鏈中，某些中間代謝物或末端代謝物的過量累積而阻遏代謝途徑中一些酶合成的現(xiàn)象。

（二）酶合成調(diào)節(jié)的機制

（1）操縱子:指的是一組功能上相關(guān)的基因，它是由啟動基因、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因三部分組成。啟動基因是一種能被依賴于DNA的RNA多聚酶所識別的堿基順序，它既是RNA多聚酶的結(jié)合部位，也是轉(zhuǎn)錄的起始點；操縱基因是位于啟動基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能與阻遏物（一種調(diào)節(jié)蛋白）相結(jié)合，以此來決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄是否能進行；結(jié)構(gòu)基因則是決定某一多肽的DNA模板，可根據(jù)其上的堿基順序轉(zhuǎn)錄出對應(yīng)的mRNA，然后再可通過核糖