第三章 基因工程

第三章基因工程第三章基因工程一、基因組的相關名詞二、DNA、基因、蛋白質(zhì)合成三、基因工程四、基因工程應用一、基因組的相關名詞1、DNA：遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸的簡稱。每個DNA分子都包含螺旋結(jié)構(gòu)的雙股鏈。2、基因：DNA上有遺傳意義的片段叫基因，基因包含一定數(shù)量的堿基。是遺傳的物質(zhì)基礎，是DNA或RNA分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列?；蚴腔A的遺傳單位，它們決定一個人眼睛的顏色、耳朵的大小、腦容量等所有人的生理特征和一些行為特征。更重要的是，基因與許多疾病有關。3、測序：確定DNA雙股鏈上每個獨立結(jié)構(gòu)單元或堿基的確切順序的過程。測序經(jīng)常被稱為“破譯”，因為其結(jié)果就像解碼一樣。解碼結(jié)果包含數(shù)百頁和成千上萬行4種字母的序列，這些字母表示4種不同的堿基，它們是腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，分別用它們的首字母A、T、C、G表示，其排列順序中蘊藏著各種各樣的遺傳信息和生命指令。4、基因診斷:也叫DNA診斷、分子診斷，是通過從患者體內(nèi)提取樣本用基因檢測方法來判斷患者是否有基因異?；驍y帶病原微生物。目前，基因診斷檢測的疾病主要有三大類：感染性疾病的病原診斷、各種腫瘤的生物學特性的判斷、遺傳病的基因異常分析。5、ＤＮＡ芯片，又稱基因芯片（ｇｅｎｅｃｈｉｐ），實質(zhì)上是一種高密度的寡聚核苷酸（ＤＮＡ探針）陣列。它采用在位組合合成化學和微電子芯片的光刻技術(shù)，或者利用其他方法將大量特定系列的ＤＮＡ片段（探針）有序地固化在玻璃或磋襯底上，從而構(gòu)成儲存有大量生命信息的ＤＮＡ芯片。6、所謂轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是把外源基因整合到動植物基因組中去。下面分別對轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因植物來進行描述。7、基因突變是指由于DNA堿基對的置換、增添或缺失而引起的基因結(jié)構(gòu)的變化，亦稱點突變。8、人類基因組（ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅ）：是建立人體所需的化學密碼或藍圖，而這幅藍圖的基本組成是ＤＮＡ。ＤＮＡ是一條由磷酸鹽和糖組成的分子鏈，呈雙螺旋形，即兩條互相纏繞的螺旋形分子帶，中間以稱為堿基的橫條緊扣。除了孿生子女外，每個人的ＤＮＡ都是獨一無二的。9、染色體（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）：人體每個細胞內(nèi)皆有２３對染色體，它們位于細胞的核心，當中染色體ＸＹ是決定性別的。一個人體內(nèi)所有細胞的染色體的長度加起來，足足有１６００億公里長。10、克隆是英文clone的音譯，簡單講就是一種人工誘導的無性繁殖方式?？寺∈侵干矬w通過體細胞進行的無性繁殖，以及由無性繁殖形成的基因型完全相同的后代個體組成的種群。通常是利用生物技術(shù)由無性生殖產(chǎn)生與原個體有完全相同基因組織后代的過程。二、DNA的結(jié)構(gòu)（一）DNA的一級結(jié)構(gòu)核苷酸鏈脫氧核糖堿基磷酸AGCT堿基核苷酸的構(gòu)成A腺嘌呤，T胸腺嘧啶，G鳥嘌呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶AGCT脫氧核糖磷酸堿基ATGCATGCNucleotide（二）DNA的二級結(jié)構(gòu)最經(jīng)典的結(jié)構(gòu)：雙螺旋結(jié)構(gòu)沃森、克里克1953年提出DNA是由兩條多核苷酸鏈彼此互補并排列方向相反的，以右手螺旋的方式圍繞同一根主軸而互相盤繞形成的，具有一定空間距離的雙螺旋結(jié)構(gòu)沃森（左）和克里克與DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型1.DNA分子有兩條反向平行的多聚脫氧核苷酸鏈組成，一條沿5’--3’，另一條3’--5’，兩條鏈沿一個假想的中心軸右旋相互盤繞，形成大溝和小溝；2.外側(cè)不變的骨架為磷酸基和脫氧核糖，可變堿基位于內(nèi)側(cè)，鏈間堿基按A==T、G==C配對形成堿基平面，該平面與假象的螺旋軸近于垂直；3.螺旋直徑為20A，相鄰剪輯平面的垂直距離為3.4A，每隔10bp螺旋結(jié)構(gòu)重復一次，故間距為34A，相鄰堿基的旋轉(zhuǎn)夾角為36°。

堿基之間一一對應，順序固定，可以保證遺傳的穩(wěn)定性。如果受到干擾，個別堿基排列順序發(fā)生變化，會導致微生物死亡或變異。DNA與RNADNARNA磷酸磷酸磷酸戊糖D－2－脫氧核糖D－核糖堿基A、G、C、TA、G、C、U核苷酸dAMP、dGMP、

dCMP、dTMPAMP、GMP、

CMP、UMPRNA的種類：tRNA、rRNA、mRNA和反義RNA.所有RNA均由DNA轉(zhuǎn)錄而來。（三）DNA的存在形式原核微生物：與很少量的蛋白質(zhì)結(jié)合，無核膜包裹，一條閉合環(huán)狀的染色體。另外還有質(zhì)粒等。真核微生物：

主要在細胞核中，與組蛋白結(jié)合，以一條或多條染色體形式存在。另外有線粒體DNA、葉綠體DNA等。（四）DNA的復制半保留半不連續(xù)復制——保證復制的精確性邊解旋邊復制，以半保留方式進行復制，親代DNA分子的一條鏈保留在子代DNA分子中，可使遺傳信息準確的傳遞給子代細胞，保持其相對的穩(wěn)定性，而不致發(fā)生變化DNA復制時，以3‘→5‘走向為模板的一條鏈合成方向為5‘→3‘，與復制叉方向一致，稱為前導鏈；另一條以5‘→3‘走向為模板鏈的合成鏈走向與復制叉移動的方向相反，稱為滯后鏈，其合成是不連續(xù)的，先形成許多不連續(xù)的片斷（岡崎片斷），最后連成一條完整的DNA鏈。復制過程：1.解旋：DNA雙鏈氫鍵斷裂，雙鏈分開；2.復制：以各自雙鏈為模板，進行復制。3.分配：新復制的核苷酸鏈與原來的一條核苷酸鏈按照堿基配對原則形成新的雙鏈結(jié)構(gòu)并分給子代。圖DNA的復制

打開雙鏈

旋轉(zhuǎn)酶

解螺旋酶

單鏈結(jié)合酶蛋白，穩(wěn)定單鏈DNA，阻止形成氫鍵

DNA聚合酶

先導鏈(leadingstrand)在DNA聚合酶作用下連續(xù)合成新股DNA

后隨鏈進行非連續(xù)合成，形成岡崎片段

DNA連接酶DNA連接酶(ligase)將非連續(xù)的岡崎片段連接起來

DNA聚合酶消解RNA引物并代之以DNA

DNA聚合酶RNA引物

聚合酶聚合酶復制叉

原雙股DNA

變性（熔解）－在加熱或某些試劑的作用下，DNA配對堿基之間的氫鍵結(jié)構(gòu)受到破壞，雙鏈DNA多核苷酸鏈能完全分離，此分離過程稱為變性。

復性－變性DNA在一定條件下能恢復其雙是螺旋結(jié)構(gòu)的過程。DNA的變性、復性與雜交變性1）變性表象ａ粘度降低ｂ沉速加快ｃ紫外吸收值增大2）影響因素ａDNA本身穩(wěn)定性ｂ外部條件3）變性研究

Tｍ復性1）影響因素ａDNA分子的大小和順序復雜性ｂ樣品的濃度ｃ溶液的離子強度

ｄ溫度2）復性條件ａ鹽濃度要高ｂ溫度要高得適當3）復性動力學滿足二級動力學

注:復雜度－DNA中最長的沒有重復序列的核苷酸對的個數(shù)值。雜交當復性的DNA分子由不同的兩單鏈分子形成時，稱為雜交。復性是分子雜交的理論基礎。（五）遺傳信息的傳遞

貯存在DNA上的遺傳信息都會轉(zhuǎn)錄到RNA上，通過RNA的翻譯作用指導蛋白質(zhì)的合成，最終依靠蛋白質(zhì)體現(xiàn)遺傳性狀。遺傳信息流動的方向:中心法則1.將攜帶遺傳信息的DNA復制；2.將DNA攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)錄到RNA上；3.將RNA獲得的信息翻譯成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄：遺傳信息從基因轉(zhuǎn)移到RNA的過程。RNA聚合酶通過與一系列組分構(gòu)成動態(tài)復合體，并以基因序列為遺傳信息模板，催化合成序列互補的RNA，包括轉(zhuǎn)錄起始、延伸、終止等過程。翻譯：在多種因子輔助下，核糖體結(jié)合mRNA模板，通過tRNA識別該mRNA的三聯(lián)體密碼子和轉(zhuǎn)移相應氨基酸，進而按照模板mRNA信息依次連續(xù)合成蛋白質(zhì)肽鏈的過程。逆轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄－以RNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成DNA的過程。

逆轉(zhuǎn)錄酶－是一種依賴于RNA的DNA聚合酶。

意義：逆轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)使我們可以用真核ｍRNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄而獲得為特定蛋白質(zhì)編碼的基因。翻譯－蛋白質(zhì)的生物合成（六）基因*是一切生物體內(nèi)儲存遺傳信息的、有自我復制能力的遺傳功能單位基因特別是指在DNA序列上，能夠表現(xiàn)出功能的部分。基因具有固定的起點和終點的核苷酸或密碼的多肽?；蚓幋a多肽?；虬垂δ芸煞秩悾航Y(jié)構(gòu)基因、操縱區(qū)、調(diào)控基因有時單一個基因便能控制一種性狀的表現(xiàn)，然而，大部分的生理性狀，都是由一系列相關的基因一同調(diào)控而表現(xiàn)E.Coli乳糖操縱子的調(diào)控ROabcmRNAmRNAmRNAABC沒有乳糖時，阻遏蛋白與操縱基因O結(jié)合，使表達處于關閉狀態(tài)，結(jié)構(gòu)基因不能表達阻遏蛋白有乳糖時，阻遏蛋白與乳糖結(jié)合，操縱基因處于打開狀態(tài)，結(jié)構(gòu)基因得以表達abc結(jié)構(gòu)基因o操縱區(qū)R調(diào)控基因ABC蛋白質(zhì)遺傳密碼(1)概念：mRNA上的堿基排列順序，相鄰的三個堿基構(gòu)成一個三聯(lián)體密碼子，代表一個氨基酸的核苷酸序列。(2)數(shù)目：密碼子共有64個，其中AUG代表起始密碼，UAA、UAG、UGA為中止密碼。P212密碼子（七）RNA即核糖核酸。RNA與DNA相似，不同之處是核糖及堿基。RNA的堿基也有四個，為U——尿嘧啶（DNA為T：胸腺嘧啶）A——腺嘌呤G——鳥嘌呤C——胞嘧啶堿基對：U—AA—UG—CC—GRNA有四種：tRNA、rRNA、mRNA、反義RNA。rRNA：核糖體RNA，與蛋白質(zhì)形成核糖體，作為蛋白質(zhì)的合成場所。

mRNA：信使RNA，帶有氨基酸的信息密碼（三聯(lián)密碼子），用于翻譯氨基酸。tRNA：轉(zhuǎn)移RNA，帶有與mRNA互補的反密碼子，能識別氨基酸和mRNA的密碼。反義RNA：起調(diào)節(jié)作用，主要決定mRNA的翻譯速度。。（八）蛋白質(zhì)合成共分成四個階段1.DNA的復制：細胞將某特定段DNA鏈進行復制。2.mRNA的轉(zhuǎn)錄：DNA雙鏈打開后，以單鏈為模板，按照堿基配對原則復制RNA。將DNA上的信息轉(zhuǎn)給RNA。3.翻譯由tRNA完成。通過反密碼子與mRNA密碼子的互補，tRNA破譯氨基酸的密碼，進而將所需氨基酸送到核糖體處。4.蛋白質(zhì)的合成按照特定的堿基順序密碼送到核糖體的氨基酸按照順序連接在一起，在酶的作用下形成多肽鏈，進而形成蛋白質(zhì)，最終將遺傳信息表達出來。TCATGATTAAGTACTAATDNA的平面結(jié)構(gòu)圖細胞核中AGTACTAATACGU游離的核糖核苷酸DNA解旋，一條鏈為模板合成RNA細胞核中ACGUAGTACTAATDNA與RNA的堿基互補配對細胞核中聚合酶ACGU游離的核糖核苷酸ACGUUU

細胞質(zhì)

核孔DNAmRNA在細胞核中合成

細胞核內(nèi)UCAUGAUUAAGTACTAATmRNAUCAUGAUUAmRNAAGTACTAATUCAUGAUUAmRNA

細胞核內(nèi)

密碼子

密碼子

密碼子

密碼子

mRNA上決定一個氨基酸的三個相鄰的堿基UCAUGAUAmRNAU

tRNA的一端運載著氨基酸

反密碼子

亮氨酸UAA天冬氨酸ACU

異亮氨酸AUG

核糖體UCAUGAUAmRNAU

亮氨酸UAA天冬氨酸ACU

異亮氨酸AUG細胞質(zhì)中

核糖體UCAUGAUAmRNAU

亮氨酸UAA細胞質(zhì)中

核糖體UCAUGAUAmRNAU

亮氨酸UAA天冬氨酸ACU

異亮氨酸AUG細胞質(zhì)中

核糖體UCAUGAUAmRNAU

亮氨酸UAA天冬氨酸ACU

異亮氨酸AUG縮合

亮氨酸天冬氨酸

異亮氨酸以mRNA為模板形成了有一定氨基酸順序的蛋白質(zhì)

細胞質(zhì)中UCAUGAUAmRNAU依照DNA上面的核甘酸序列，可翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸序列，這是如何做到的？

(1)DNA的序列可以A=U及C=G的互補關系，轉(zhuǎn)成messengerRNA。

(2)mRNA與核糖體結(jié)合，準備開始進行轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)。

(3)mRNA序列以三個為一組，稱為“遺傳密碼”，每組密碼可對應一種氨基酸。

(4)由RNA譯成胺基酸序列時，需要有“翻譯者”，此翻譯者即為

tRNA。

(5)每個

tRNA可說是一種介面，一邊認得特定的

RNA密碼，一邊攜帶對應的氨基酸。

(6)當

tRNA一邊認出其特定密碼，一邊可把所攜帶的氨基酸接上連成蛋白質(zhì)。三、基因工程基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。是在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞內(nèi)進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物?；蚬こ淌侵赴凑杖藗兊脑竿?，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。（一）、基因工程大事記1973Cohen第一例成功的克隆實驗1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物

1982

第一個基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準使用

1985

第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國轉(zhuǎn)基因魚

1993

基因工程西紅柿在美國上市1997

英國羅斯林研究所多莉羊1999.9

中國獲準加入人類基因組計劃.負責測定人類基因組全部序列的1%2000.6.26

科學家公布人類基因組工作草圖2001.2.11

公布人類基因組基本信息生物技術(shù)工程：基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程胰島素人生長激素干擾素白細胞介素2粒細胞集落刺激因子粒細胞巨噬細胞集落刺激因子紅細胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長激素促生長素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體54基因決定性狀青霉菌能產(chǎn)生對人類有用的抗生素——青霉素（二）、基因設想55基因決定性狀豆科植物的根瘤能夠固定空氣中的氮56基因決定性狀家蠶能夠吐出蠶絲為人類利用57定向基因改造設想

設想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細菌“吐出”蠶絲？設想二能否讓微生物產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設想三經(jīng)過多年的努力，科學家于20世紀70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。58（三）、基因工程過程示意圖①從細胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因59（四）、基因工程操作的工具將目的基因片斷從人體細胞內(nèi)提取，需要基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶。將目的基因與運載體DNA連接，需要基因的針線——DNA連接酶。將目的基因運入大腸桿菌，需要基因的運輸工具——運載體。601、限制性內(nèi)切酶分布：主要在微生物中。特點：特異性，即識別特定核苷酸序列，切割特定切點。結(jié)果：產(chǎn)生黏性未端（堿基互補配對）。舉例：大腸桿菌的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割點上將DNA分子切斷。目前已發(fā)現(xiàn)的限制酶有200多種。61限制性內(nèi)切酶作用過程點擊播放622、DNA連接酶連接酶的作用：將互補配對的兩個黏性末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子。連接的部位：磷酸二酯鍵，不是氫鍵。問題用DNA連接酶連接兩個相同的黏性未端要連接幾個磷酸二酯鍵？63DNA連接酶的作用過程點擊播放643、運載體將外源基因送入受體細胞。條件：能在宿主細胞內(nèi)復制并穩(wěn)定地保存。具有多個限制酶切點。具有某些標記基因要讓一個從甲生物細胞內(nèi)取出來的基因在乙生物體內(nèi)進行表達，首先得將這個基因送到乙生物的細胞內(nèi)去。能將外源基因送入細胞的工具就是運載體。常用運載體：質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒質(zhì)粒存在：存在于細菌及酵母菌的染色體以外。特性：是很小的環(huán)狀DNA分子，在細胞染色體外能夠自我復制。65質(zhì)粒的特點細胞染色體外能自主復制的小型環(huán)狀DNA分子；質(zhì)粒是基因工程中最常用的運載體；最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒；存在于許多細菌及酵母菌等生物中；質(zhì)粒的存在對宿主細胞無影響；質(zhì)粒的復制只能在宿主細胞內(nèi)完成。問題要想將某個特定基因與質(zhì)粒相連，需要幾種限制性內(nèi)切酶和幾種DNA連接酶處理？

大腸桿菌質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)示意圖大腸桿菌質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)示意圖基因進入受體細胞的運載體天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？作為運載體的條件：（1）必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到運載體上去，而且這些位點所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。（2）必需具備自我復制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。（3）必需帶有標記基因，以便重組后進行重組子的篩選。（4）必需是安全的，不會對受體細胞有害，或不能進入到受體細胞外的其他生物細胞中的。（5）分子大小應適合，以便提取和在體外進行操作。故天然的DNA分子一般不能直接用做基因工程運載體。（五）、基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲??；2、基因表達載體的構(gòu)建；3、將目的基因?qū)胧荏w細胞；4、目的基因的檢測與鑒定；1、目的基因的獲取目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因，獲取目的基因是實施基因工程的第一步。如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。目的基因的提取方法（1）直接分離基因：鳥槍法（2）人工合成基因：反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA鳥槍法：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細胞，讓供體細胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制（即擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再利用一定發(fā)方法將目的基因的DNA片段分離出來。用限制酶切斷成許多片段人工合成基因法1）反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA)雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因?qū)Ｒ恍詮姴僮鬟^程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù)？1）DNA序列自動測序儀：對提取出來的基因進行核苷酸序列分析。2）PCR技術(shù)：使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增。利用PCR技術(shù)擴增目的基因利用PCR技術(shù)擴增利用PCR技術(shù)擴增①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________(做啟動子)、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA復制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增PCR技術(shù)擴增過程a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板，在熱作用下，_氫鍵_斷裂，形成_ssDNAb、退火annealing）（復性25℃-65℃）：（溫度下降，變性DNA復性，使寡核苷酸引物即與模板DNA中所要擴增序列兩端的堿基配對。

c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的__DNA鏈______。d、重復變性、退火和延伸三步操作，DNA片段呈2的指數(shù)增長，在1－2小時內(nèi)重復25－30次循環(huán)，擴增的DNA片段拷貝數(shù)可增加至106～107倍。3）從基因文庫中獲取目的基因：基因文庫:

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫?；蚪M文庫:

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫:

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.2、基因表達載體的構(gòu)建——核心目的：單獨的DNA片段──目的基因是不能穩(wěn)定遺傳的。構(gòu)建表達載體的目的是為了使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用。2、基因表達載體的構(gòu)建——核心①用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。②用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生同樣的黏性末端。③將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。2、基因表達載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）經(jīng)此過程，基因表達載體的構(gòu)建就成功了？同一種限制酶2、基因表達載體的構(gòu)建——核心基因表達載體的組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因啟動子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地主停止下來。2、基因表達載體的構(gòu)建——核心作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還要有啟動子、終止子和標記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；3、將目的基因?qū)胧荏w細胞轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。3、將目的基因?qū)胧荏w細胞方法：將目的基因?qū)胫参锛毎恨r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（雙子葉植物和祼子植物）、基因槍法（單子葉植物）、花粉管通道法將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射法將目的基因?qū)胛⑸锛毎惺軕B(tài)細胞將目的基因?qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胛⑸锛毎竽c桿菌細胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是:

首先用Ca2+

處理細胞,以增大細菌細胞壁的通透性,使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細胞稱為感受態(tài)細胞.

第二步是將重組表達載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合,在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過程.

第二步目的基因在受體細胞內(nèi)，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非?？?，在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。3、將目的基因?qū)胧荏w細胞導入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少要對受體細胞作怎樣的處理？對受體細胞中是否導入了目的基因進行檢測怎樣進行檢測？通過目的基因上的標記基因，進行篩選和檢測4、目的基因的檢測與鑒定檢測：（分子水平）①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因：方法——DNA分子雜交②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA：方法——DNA分子雜交③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)：方法——抗原——抗體雜交（如果有，表示目的基因已經(jīng)進行了翻譯）DNA分子雜交技術(shù)分子探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片段（目的基因片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于對待測核酸樣品中特定基因順序的探測。

滿足條件：（1）必須是單鏈；（2）帶有容易被檢測出來的標記物（如放射性同位素標記）。核酸分子雜交實質(zhì)上是用已知序列的DNA或RNA片段作為探針與待測樣品的DNA或RNA序列進行核酸分子雜交。DNA分子雜交示意圖如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。DNA分子雜交示意圖用DNA分子雜交技術(shù)可鑒定兩個物種之間的親緣關系的遠近。將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。如果雜合部位多，則親緣關系近，反之則遠。4、目的基因的檢測與鑒定鑒定：（個體水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等4、目的基因的檢測與鑒定將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落，保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物四、基因工程的應用（一）、植物基因工程碩果累累（二）、動物基因工程前景廣闊（三）、基因治療曙光初照（四）、基因工程與環(huán)境保護（一）、植物基因工程碩果累累轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)主要用于提高農(nóng)作物的抗逆能力,以及改良弄作物的品質(zhì)和利用植物生產(chǎn)藥物等方面