第1章 組織培養(yǎng)技術的基本理論知識(新修)

組織細胞培養(yǎng)技術主講：周曉霞司徒鎮(zhèn)強

第一章

細胞培養(yǎng)的基本理論知識

組織培養(yǎng)工作開始于20世紀初，Harrison(1907)最早對兩棲類胚胎的神經管組織進行了懸滴培養(yǎng)-哈里森懸滴培養(yǎng)法

真正開創(chuàng)大規(guī)模細胞培養(yǎng)工作是在20世紀40年代，W.Earle和R.Dulbecco設計出了細胞培養(yǎng)液配方，并開始了單細胞的懸液培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)工作才得到廣泛發(fā)展。

細胞培養(yǎng)始傳我國是20世紀30年代。至50年代以后，組織培養(yǎng)已在我國逐步開展起來組織細胞培養(yǎng)的誕生和發(fā)展簡史

第一節(jié)細胞培養(yǎng)基本概念

一、細胞培養(yǎng)(cellculture)基本概念：

動物細胞與組織培養(yǎng)是從動物體內取出細胞或者組織，模擬體內的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細胞或者組織生存、生長并維持結構和功能的一門技術。

體外培養(yǎng)細胞培養(yǎng)（InVitro）

組織培養(yǎng)

器官培養(yǎng)

一、什么是細胞培養(yǎng)？

(cellculture)

概念體外培養(yǎng)（Invitro）**

細胞培養(yǎng)(cellculture)：

是把取得之組織用機械或消化的方法分散成單個細胞懸液，然后進行培養(yǎng)生長。**

組織培養(yǎng)(Tissueculture)：

把活體的一小片組織置于底物上孵育，細胞自其周圍移出并生長。

**器官培養(yǎng)(Organculture)：系將活體中器官或一部分器官取出，置于體外生存、生長并同時保持其一定的結構和功能特征。多種學科均可利用細胞培養(yǎng)進行研究，如：細胞學、免疫學、腫瘤學、生化學、遺傳學、分子生物學等。可供實驗的組織來源眾多，包括各種動物的各類組織，可以是動物的胚胎或成體；可以是正常組織或腫瘤組織等?？寺⊙蚨嗬蚩寺『飭慰寺】贵w制備過程

優(yōu)點：

1.活細胞：

能長時間、直接觀察、研究活細胞的形態(tài)、結構、生命活動等

二、細胞培養(yǎng)的優(yōu)點與缺點2.可控制：

選擇對象：均一性、重復性

哪一種：類型：上皮？間質？

性質：正常？腫瘤？

階段：

調節(jié)條件：物理、化學、生物等因素可控

研究方法：可采用各種研究技術、記錄方法

3.應用廣：學科多，對象廣。

4.較經濟：

可提供大量、同時、重復性好的、生物學性狀相似的實驗對象

細胞培養(yǎng)技術的主要優(yōu)點(小結）㈠研究的對象是活細胞。㈡研究的條件可以人為控制。㈢研究的樣本，可以達到比較均一性。㈣研究的內容便于觀察、檢測和記錄。㈤研究的范圍比較廣泛。㈥研究的費用相對較經濟。缺點：雖然現(xiàn)在人工模擬體內環(huán)境的技術已經很高,但人工所模擬的條件與體內實際仍不完全相同。當細胞被置于體外培養(yǎng)后,生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中久了，必然發(fā)生變化。１.與體內主要不同相對孤立、相對單一，缺乏體內的系統(tǒng)作用、失去神經體液的調節(jié)和細胞相互間的影響。2.主要表現(xiàn)

失去原有組織結構和細胞形態(tài)，分化減弱或不顯，細胞趨向單一化；3.提示

要正確認識體外培養(yǎng)細胞：是一種特定條件下生長的細胞群體。

體內、外細胞的差異:體內細胞：

機體神經體液調節(jié)和其他類型細胞影響

基因表達受到外來信號調節(jié)

增殖過程中不斷發(fā)生著分化（由一般到特殊）

高度特化的結構和功能體外細胞：失去機體神經體液調節(jié)和其他類型細胞影響細胞的許多外來信號被切斷特定分化基因表達減弱或停止而進化中保守的增殖活動維持（由特殊到一般）與體內細胞結構和功能的差異特征：失去原有形態(tài)，分化特性減弱，形態(tài)和功能趨于單一，一定代數后衰老死亡，或發(fā)生轉化，獲不死性而成為能無限傳代

第二節(jié)組織培養(yǎng)的細胞生物學

一、體外培養(yǎng)細胞的生長類型

按生長方式分為二型

粘附型細胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。

懸浮型細胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。

絕大多數有機體細胞屬粘附型細胞。

粘附型細胞：粘附:是大多數有機體細胞在體內生存和生長發(fā)育的基本存在方式

有機體的絕大多數細胞必須粘附于一固相表面才能生存和生長。

細胞在體內、外的粘附方式存在差異：

體內：粘附是全方位，外形具有復雜的立體特征

體外：多數情況，細胞只有一個附著平面，外形一般與體內時明顯不同按照培養(yǎng)細胞的主要形態(tài)，可分為以下類型：

(1)上皮型細胞(2)成纖維型細胞(3)游走型細胞(4)多形型細胞

(1)上皮型細胞(2)成纖維型細胞(3)游走型細胞(4)多形型細胞

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上皮樣細胞型

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與上皮細胞類似的細胞來源：來源于外胚層，內胚層細胞（個別例外）如：皮膚及其衍生物消化道，乳腺，肺泡，上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內的上皮細胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核

生長特點:易相連成片:相靠—緊密相連—成薄層—鋪路石狀;生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動

成纖維細胞樣細胞

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的細胞來源：由中胚層間充質組織起源的組織如：真正的成纖維細胞心肌，平滑肌，成骨細胞，形態(tài)：似體內成纖維細胞的形態(tài)胞體梭形或不規(guī)則三角形胞質向外伸出2—3個長短不等的突起中有卵圓形核

生長特點:

排列成放射狀，漩渦狀并不緊靠連成片;細胞—細胞接觸易斷開而單獨行動游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起

體外培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細胞游走型細胞

具有類似巨噬細胞樣的特征。經常處于較活躍的變形及游走狀態(tài)，因此外形不規(guī)則且不斷變化。當細胞密度增大相互連接成片時，游走受限，形狀上類似上皮型細胞或成纖維細胞型的細胞。表現(xiàn)這種形態(tài)的細胞主要是具有吞噬作用的單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞，如顆粒性白細胞、淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、肝庫佛細胞(Kupffercell)以及某些腫瘤細胞等。

多形型細胞

多形型細胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細胞，但它不像成纖維細胞型的細胞那樣，不規(guī)則形態(tài)由寬扁的胞質突起所致。其細胞一般分胞體和胞突兩部分。胞突為細長形，似絲狀偽足。胞體雖略呈多角形，但沒有成纖維細胞型那樣不規(guī)則。體外培養(yǎng)中呈現(xiàn)多形型的細胞最常見的類型是神經元和神經膠質細胞。注意：細胞形態(tài)并非固定不變，可隨培養(yǎng)條件、生長時期、細胞數量等而變化細胞形態(tài)只是對培養(yǎng)物判斷或識別的參考指標若要確定某一培養(yǎng)物的確切細胞類型，必須借助更為特異的鑒定方法，如進行組織化學或免疫細胞化學染色鑒定。培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定:條件改變，細胞形態(tài)可有變化

血清高血清低血清

Hela成纖維細胞樣上皮樣細胞

pH

太酸或太堿標準pH

Hela成纖維細胞樣上皮樣細胞

細胞密度低密度高密度

3T3成纖維細胞樣上皮樣細胞

生長狀態(tài)改變

懸浮或貼附懸浮貼附

3T3圓形成纖維或上皮樣

轉化與否未轉化轉化后3T3成纖維樣可成上皮樣懸浮生長型

概念培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長來源來自血，脾或骨髓，主要是血中白細胞腫瘤細胞也可能特點在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團優(yōu)點:

生存空間大，提供數量大傳代方便(不需消化)易于收獲缺點:

觀察不方便很多細胞不能懸浮生長(尤其是正常細胞)

小結*：體外培養(yǎng)細胞的生長類型粘附型細胞懸浮型細胞：血細胞以及某些腫瘤細胞

上皮型細胞成纖維型細胞

游走型細胞

多形型細胞

培養(yǎng)細胞分化狀態(tài)的變化分化特征逐漸減弱，原本各種各樣的分化細胞，逐漸失去各自的形態(tài)與功能“個性”，表現(xiàn)出某種趨同性，這種現(xiàn)象被稱為去分化或脫分化培養(yǎng)細胞的增殖能力

分裂增殖和生長發(fā)育是體外培養(yǎng)細胞的兩大生命特征;增殖能力一般與該種細胞在體內的增殖能力相仿。

根據增殖狀況，體內細胞分三類：·連續(xù)分裂細胞(cyclingcell):這類細胞始終保持著活躍的分裂能力。如造血組織，胃腸粘膜上皮，體表皮細胞等。特點：細胞代謝旺盛，壽命較短，更替快。

·休眠細胞(Go細胞):在平常情況下它們不進行分裂，如肝、腎、甲狀腺等細胞，但在一定條件下，可以重新進入細胞周期，出現(xiàn)活躍的細胞分裂?！そK末分化細胞:終生不再分裂。二、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程１）單個細胞的生長過程：ＤＮＡ合成細胞分裂

復習：細胞周期＝Ｇ１＋Ｓ＋Ｇ２＋Ｍ細胞通過什么方式增殖？細胞以分裂的方式進行增殖細胞增殖一個細胞周期分四個時期：G1、S、G2、M期。G1SG2MG0

概念：連續(xù)分裂的細胞，從一次分裂完成時開始，到下一次分裂完成時為止，為一個細胞周期。細胞周期

階段分裂間期：G1、S、G2分裂期：

M期前期中期后期末期

細胞沿著G1→S→G2→M→G1周期性運轉，在間期細胞體積增大(生長)，在M期細胞先是核分裂，接著胞質分裂，完成一個細胞周期。一次分裂結束下次分裂開始下次分裂結束分裂間期分裂期細胞周期①細胞的種類不同，一個細胞周期的時間也不相同。②分裂間期的時間遠遠大于分裂期的時間。（90%--95%）

（5%--10%）規(guī)律:細胞周期中各期的生化特點:G1期：從有絲分裂完成到DNA復制之前這一階段，又稱為復制前期。該期細胞內各種RNA、蛋白質、糖、脂等合成增多。同時該期是各種細胞群體之間細胞周期的差異取決于此期。S期：又稱為DNA合成期或復制期。該期細胞內遺傳物質從二倍體到四倍體。同時組蛋白的合成也同時進行。G2期：指DNA合成完成到有絲分裂開始這段時間，又稱復制后期。該期DNA合成已終止，但仍然進行著RNA和一定蛋白合成。同時線粒體DNA在此期復制。M期：又稱為有絲分裂期。此期細胞呈球形，染色體在此期凝聚后分開，移向細胞兩端，解聚并再形成兩個完整的核，最后