第10章經典液相色譜法

經典

液相色譜§1

LSC

§2

LLC§3ICE§4SCE§5TLC§6PC第10章

經典液相色譜法包括經典柱色譜法和平面色譜法，是在常壓下靠重力或毛細作用輸送流動相的色譜方法。經典色譜法與現代色譜法的區(qū)別主要在于輸送流動相方式、固定相種類和規(guī)格、分離效能、分析速度和檢測靈敏度等方面。經典液相色譜法設備簡單，操作方便，分析速度快。在藥物研究、食品化學、環(huán)境化學、臨床化學、法檢分析及化學化工等領域都有廣泛的應用。特別是在天然藥物成分的鑒別、分離等方面發(fā)揮著獨特的作用，是中藥鑒別的主要方法之一。

第1節(jié)液-固吸附柱色譜法（LSC）

經典的液—固吸附色譜（liquidsolidadsorptionchromatography，LSC）是以吸附劑為固定相，有機溶劑為流動相，利用不同組分在吸附劑上吸附性能的差異，進行分離分析的方法。

用于分離分析極性至弱極性的化合物，不適用于分離分析強極性的物質。一、基本原理1．吸附與吸附平衡吸附是指溶質分子與吸附劑分子之間所存在的某些化學作用力而被吸附在吸附劑的表面。吸附過程則是試樣中溶質分子（X）與流動相分子（Y）爭奪吸附劑表面活性中心的過程，即為競爭吸附過程（圖10-1）。圖10-1吸附色譜示意圖m.流動相a.吸附劑Xm.流動相中溶質分子Ym.流動相分子Xa.被吸附的溶質分子

吸附平衡常數:由于流動相分子是大量的,所以[Ym]/[Ya]可視為常數。

∴（10-2）

為吸附劑的表面積，為流動相的體積，Cs為溶質在固定相的濃度，Cm為溶質在流動相中的濃度。吸附平衡常數K是與組分的性質、吸附劑和流動相的性質與溫度有關的一個常數。

K值小，說明該物質被固定相吸附得不牢固，易被流動相分子解吸附，在固定相中滯留時間短，在柱中移動速率快，先流出色譜柱；若K值大，說明該物質被吸附得牢固，在固定相中滯留時間長，移動速率慢，后流出色譜柱，2吸附等溫線

一定溫度與壓力下,某組分在吸附劑表面吸附平衡,該組分在兩相中的濃度相關曲線。（1）線性吸附等溫線吸附平衡常數K為一定值時，則吸附等溫線為線型。即達到平衡時，組分在固定相中的濃度Cs與其在流動相中的濃度Cm

成正比(Cs=KCm)，直線的斜率為K。線型吸附等溫線是理想的等溫線，同一種溶質的平衡常數K與溶液的濃度無關，即K為一常數。組分流出速度不受濃度的影響，故在洗脫或展開時，同一溶質分子在柱內具有相同的遷移速率，能得到左右對稱的流出曲線。如圖10-2A所示。（2）凸形吸附等溫線在絕大多數情況下，吸附等溫線都有些彎曲而呈現凸形吸附等溫線。其中主要原因之一是固體吸附劑表面的不均一性。例如硅膠表面上有幾種吸附能力不同的吸附中心——強的、較強的、弱的、極弱的

同一溶質分子總是先占據強的吸附中心，兩者之間作用力強，溶質分子被吸附得牢，吸附平衡常數K值大，遷移速率慢；后占據弱的吸附中心，兩者之間作用力弱，吸附平衡常數K值小，遷移速率快，并依此類推。顯然，同一溶質分子具有不同的吸附平衡常數K，即具有不同的遷移速率。在溶質分子集中的區(qū)域，吸附劑的所有吸附中心達到吸附飽和，K值小，遷移速率快，先流出色譜柱；在溶質分子稀少的區(qū)域，由于僅僅占據了強吸附中心，K值大，遷移速率慢，后流出色譜柱。從而導致流出曲線前沿陡峭，后沿拖尾，形成拖尾峰，且保留時間亦隨樣品量的增加而減小。如圖10-2B所示。（3）凹形：由于進樣量較大，影響了固定相的物理性質。隨溶質量的增加,Cs/Cm增加，所以呈凹形。吸附等溫柱內溶質濃度分布柱內溶質濃度的分布曲線流出曲線保留時間與進樣量的關系拖尾峰的出現對以下產生了不利的影響：①利用峰面積進行定量時峰面積的積分精度和重現性。②利用峰高定量時檢測的靈敏度。③定性分析時保留值與物質性質的相關性。④組分之間相互分離的程度。因此應盡量避免色譜峰的拖尾?？朔姆椒ㄊ牵簻p小進樣量或樣品的濃度，即利用凸形吸附等溫線的直線部分，從而得到左右對稱的流出曲線。二、吸附劑對吸附劑的要求：(1)表面積大，具有一定的吸附能力。(2)不應與流動相發(fā)生化學反應。(3)粒度要細，一般要150目。1.吸附劑：常用的有：氧化鋁、聚酰胺、硅膠等。酸性pH=5～4

分離酸性物質.如氨基酸(1)中性pH=7.5氧化鋁

分離生物堿.如揮發(fā)油,甾體等堿性pH=9～10

分離堿性.如生物堿(2)硅膠:吸附能力稍弱于氧化鋁,用于分離弱酸與中性物(如有機酸、氨基酸、甾體等)。硅醇基是使硅膠有一定吸附能力的活性基團。

三種存在形式:

吸附能力：Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ活性大小：Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ(3)聚酰胺:由酰胺聚合而成的高分子物質。

其吸附原理利用分子內酰胺基和羰基。

酰胺基中的羰基與酚類、黃酮類、酚類中的羥基或羧基形成氫鍵；

酰胺基中的氨基與醌類、硝基類中的醌基、硝基形成氫鍵而產生吸附作用。不同的化合物，由于活性基團的種類、數目與位置的不同，形成氫鍵的能力不同，而實現分離。對位間位取代基均能形成氫鍵的,吸附力增大。鄰位基團間能形成分子內氫鍵的,吸附力減小。芳香核具有較多共軛鍵時,吸附力增大。（4）大孔吸附樹脂大孔吸附樹脂是一種不含交換基團，具有大孔網狀結構的高分子吸附劑。粒度多為20-60目。理化性質穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機溶劑。大孔樹脂可分為非極性和中等極性兩類，在水溶液中吸附力較強且有良好的吸附選擇性，而在有機溶劑中吸附能力較弱。大孔吸附樹脂主要用于水溶性化合物的分離純化，近年來多用于皂苷及其它苷類化合物與水溶性雜質的分離。也可間接用于水溶液的濃縮，從水溶液中吸附有效成分。硅膠含水量（%）氧化鋁含水量（%）活度級別051525380361015ⅠⅡⅢⅣⅤ表10-1硅膠、氧化鋁的含水量與活度級別的關系2.吸附劑的活性：氧化鋁、硅膠的吸附力的大小,還與其含水量有較大的關系：注意:吸附劑的吸附活性(能力)與活度級別的相反關系活度級數含水量活性吸附能力小少大強大多小弱

所以，加熱除水，活性提高，吸附力加強。加一定水，活性下降，吸附力減弱。

活化：105～110℃加熱除水為活化。脫活：加一定水份，降低活性。三、色譜條件的選擇由于吸附劑的種類有限，因此，當被分離物質、吸附劑種類一定時，分離成敗的關鍵取決于流動相的選擇

流動相又稱洗脫劑、展開劑或移動相。要求:1.純度高2.穩(wěn)定(對樣品和吸附劑不反應)3.對樣品溶解度大4.粘度小(易洗脫)。1.被分離物質的極性被分離物質的極性越大,被吸附劑吸附得越牢!常見的化合物極性大小順序:

烷烴<烯烴<醚類<硝基化合物<二甲胺<脂類<酮類

<醛類<硫醇<胺類<酰胺<醇類<酚類<羧酸類被分離物質的極性與結構的關系(1)基本母核相同,基團極性愈大,分子極性愈大?；灸负讼嗤?極性基團數目愈多,分子極性愈大。

(2)分子雙鍵多,吸附力↑,共軛度↑,吸附性↑

。(3)空間排列,影響極性。

如：2.吸附劑的活性:

吸附劑的活性↑大，對被測組分的吸附能力↑強

被分離物質的極性吸附劑活性大應選→小防吸附太牢,難洗脫小應選→大防tR太小,不易分離

3.流動相:流動相極性↑大，對被測組分的洗脫能力↑大常用流動相極性強弱順序:石油醚<環(huán)己烷<四氯化碳<苯<甲苯幾<乙醚<氯仿<醋酸乙酯<正丁醇<丙醇<乙醇、甲醇<水

被分離物質的極性吸附劑活性流動相極性

大小大小大小

以上三方面只是一般性原則,至于使用哪種,要由實驗來摸索。流動相選擇靈活性很大,往往可用一元,配兩元或三元

。也可采用梯度洗脫等技術。圖10-3

化合物極性\吸附劑活度和洗脫劑極性間的關系四、操作方法

1．色譜柱的制備

內徑與柱長的比例，一般在1:10～20之間.

顆粒大小一般應在100~200目

樣品重量:氧化鋁重量=1:20~50，對于難分離化合物，氧化鋁用量可增加至100~200倍；

硅膠作固定相其比例一般為1:30~60，如為難分離化合物，可高達1:500~1000。(1)玻璃柱干法裝柱濕法裝柱

（2）尼龍柱2．加樣與洗脫

加樣的方法有三種：①試樣配成濃溶液，用吸管輕輕沿管壁加入柱內，然后加流動相洗脫。②③用一塊比色譜柱內徑略小的圓形濾紙吸附試樣溶液，待溶劑揮發(fā)后，加入柱內，然后加流動相洗脫。洗脫時,應連續(xù)不斷地加入洗脫劑，切勿斷流。

并調節(jié)一定的流速。3．檢出可以通過分段收集流出液，采用相應的物理和化學方法進行檢出。對有色混合物，很容易觀察化合物的分離情況，對無色物質，可用紫外光觀察熒光色帶而檢出。也可用熒光吸附劑，通過熒光熄滅定位。

第2節(jié)液～液分配柱色譜法（LLC）1940年英國人Maritin(馬丁),Sngger(辛格)分配色譜獲諾貝爾獎金。1952年兩人再度合作,發(fā)明氣相色譜。經典的液—液分配色譜(liquidliquidpartitionchromatography，LLC)是將某種溶劑（固定液）涂布在多孔微粒的表面或紙纖維上，形成一層液膜，構成固定相。多孔微?；蚣埨w維稱為支持劑(solidsupport)或載體(carrier)、擔體。一、基本原理:

有些強極性化合物,能被吸附劑強烈吸附,即使使用洗脫能力很強的流動相也難推動,從而使吸附色譜無法分離。為克服之，發(fā)明了液—液色譜。利用混合物中各組分在兩相中溶解度不同而達到分離。

K=Cs/Cm二、載體載體(擔體):惰性物質,要有較大的表面積(起負載固定液的作用)。有硅膠、纖濰素、硅藻土等三、固定液及其選擇正相分配色譜，其固定相的極性大于流動相，即以強極性溶劑作為固定液，以弱極性的有機溶劑作為流動相；

反相分配色譜，其固定液具有較小的極性，而流動相則極性較大。正相反相固定相極性大小流動相極性小大適于分離的物質極性物質中等極性至非極性的物質流出順序極性小的組分先流出柱極性大的組分先流出正相色譜與反相色譜的比較在正相分配色譜法中，固定液有水、各種緩沖溶液、稀硫酸、甲醇、甲酰胺或丙二醇等強極性溶劑，以及它們的混合液.在反相分配色譜中，常以硅油、液體石蠟等極性較小的有機溶劑作為固定液，而以水、水溶液或與水混溶的有機溶劑為流動相。四、流動相及其選擇一般正相色譜法常用的流動相有石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷類、苯等或它們的混合物。

反相色譜法常用的流動相則為正相色譜法中的固定液如水、各種水溶液(包括酸、堿、鹽及緩沖液)或低級醇類等。注意點：流動相在使用之前，必須先用固定相飽和,以防固定相流失五、操作方法

1．固定液的涂布與裝柱裝柱前，首先將固定液與載體混合。如果用硅膠、纖維素等作載體時，可直接稱出一定量的載體，再加入一定比例的固定液，混勻后即可裝柱。

2．加樣和洗脫第3節(jié).離子交換色譜固定相:離子交換樹脂流動相:水溶液或緩沖液分離機制:差速遷移分離對象:離子化合物(一)樹脂分類:具有網狀立體結構的高分子聚合物。

聯(lián)上酸性基團：陽離子交換樹脂（-SO3H,-COOH等）聯(lián)上堿性基團：陰離子交換樹脂（-NH2,-NHR等）陽離子交換反應：(樹脂可反復使用,用HCL浸泡,沖洗)陰離子交換反應：

(陰離子樹脂的再生,用適當的堿液浸泡)nRSO3H+Mn+交換洗脫(RSO3)nM+nH+用NaOH滴定H+，由耗V求X%(樹脂再生)N(CH3)3+OH

-R+Cl

-交換洗脫N(CH3)3+Cl

-R+OH

-用酸液滴定可求X%H+(二)樹脂的性能:

1.交聯(lián)度:交換樹脂中,交聯(lián)劑(二乙烯苯)的含量為交聯(lián)度,以重量百分比表示。

交聯(lián)度網眼交換體積大的離子大小慢不易進入小大快大小離子均可進入陽離子交換樹脂一般交聯(lián)度8%(常用)陰離子交換樹脂一般交聯(lián)度4%2.交換容量:

每克樹脂能參加交換反應的活性基團數。單位:mmol/g;mmol/ml3.粒度:以溶漲態(tài)所能通過篩孔來表示。10～50目—交換水用;100～200目—分析用。(三)離子交換平衡常數:

1.[A+]r、[B+]r分別表示樹脂中A、B離子的濃度;[A+]、[B+]分別表示水液中A、B離子的濃度;若

KB/A>1,說明B+較牢地結合在樹脂上

KB/A<1,說明A+較牢地結合在樹脂上所以KB/A說明了樹脂對A+、

B+兩種離子選擇性交換的能力,故也稱之為選擇性系數。KB/A

↑,B與樹脂結合能力強,洗脫慢,tR

↑。2.選擇性系數與分配系數的關系:

即:分配系數不同是離子交換分離的先決條件。

要求：固定相→離子交換樹脂流動相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機物或無機物分離機制見圖示分離機制：

依據被測組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實現分離第4節(jié)空間排阻柱色譜法（SEC）

空間排阻色譜(stericexclusionchromatography，SEC)是20世紀60年代發(fā)展起來的一種色譜分離方法，又稱為：凝膠色譜法(gelchromatography)

分子排阻色譜法(molecularexclusionchromatography)分子篩色譜法(molecularsievechromatography)尺寸排阻色譜法(sizeexclusionchmmatography)。該色譜法根據流動相的不同又可分為兩類：以有機溶劑為流動相者，稱為凝膠滲透色譜法(gelpermeationchromatography，GPC)；以水溶液為流動相者，稱為凝膠過濾色譜法(gelfiltrationchromatography，GFC)。主要用于大分子物質如蛋白質、多糖等的分離。一、基本原理

以凝膠（有機高分子的多孔聚合物）作為固定相，有機溶劑或水溶液作為流動相，利用樣品中不同組分的分子尺寸的差異以實現混合物的分離。分離機制：利用被測組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實現分離.要求：固定相→多孔性凝膠流動相→水——凝膠過濾色譜流動相→有機溶劑——凝膠滲透色譜分離機制見圖示滲透系數

注：Kp僅取決于待測分子尺寸和凝膠孔徑大小，與流動相的性質無關第5節(jié)薄層色譜法TLC

操作流程:鋪板—活化—點樣—飽和—展開—顯色—定性,定量。

一.基本原理:

1.分離過程

將混合組分的試液,點在鋪了吸附劑的玻璃板一端,在密閉容器中用適當的溶劑(展開劑、流動相)展開,各組分不斷地被吸附,解吸附…隨展開劑前移,利用吸附劑對不同組分的吸附力(吸附常數)不同,產生差速遷移,而達到分離。特點:快速、靈敏(幾～幾十微克)、高選擇、顯色方便。

RfA=a/cRfB=b/c2.比移值

比移值當固定相、流動相一定時，Rf與與組分性質K的關系如下：色譜條件一定，Rf只與組分性質有關，是薄層色譜基本定性參數，說明組分的色譜保留行為Rf=0未移行(被固定完全吸附,K

)Rf=1移至前沿(組分不被固定相吸附,K

0)

一般:0＜Rf＜1

1）固定相、流動相一定時，Rf值與物質極性的關系是：物質的極性↑大，K↑大，吸附得越牢，移動距離越小，Rf↓小物質的極性↓小，K↓小，吸附得越弱，移動距離越大，Rf↑大

2）固定相、組分的極性一定時，Rf值與展開劑極性的關系是：展開劑極性↑大，Rf↑大（容易洗脫）展開劑極性↓小，Rf↓?。ú蝗菀紫疵摚?/p>

3）展開劑、組分的極性一定時，Rf值與固定相吸附力的關系是固定相吸附力↑大，Rf↑小固定相吸附力↓小，Rf↑大

Rf最佳范圍:0.3～0.5,也可控制在0.2～0.8范圍內。

3．相對比移值某物質，當色譜條件一致時，Rf定值，定性用，但重現性差。有人建議用相對比移值定性。

參考斑點可以是另加的物質,亦可以樣品中另一組分為參考。4.分離度分離度（R）的計算公式為：d2為第2個色譜斑點的中心與原點的間距d1為第1個色譜斑點的中心與原點的間距W1及W2為相鄰兩斑點的直徑一般分離度應大于1.0。123456溶劑前沿T=23℃RH=62%圖1延胡索薄層色譜鑒別（365nm紫外光燈檢視）1.婦科養(yǎng)坤丸(EEC002)2.婦科養(yǎng)坤丸(EEC001)3.婦科養(yǎng)坤丸(E05005)

4.延胡索對照藥材5.延胡索乙素對照品6.延胡索陰性對照圖一：硅膠HPTLC分離金光菊屬植物（紫錐花類）根部提取物，從左到右分別為：海膽苷、咖啡酰酒石酸、紫錐菊、紫錐菊－蒲草（75％:25％）、紫錐菊－蒲草（50％:50％）、紫錐菊－蒲草（25％:75％）、蒲草、洋薊酸、菊聚酸。二.固定相

1.吸附柱色譜的固定相薄層色譜也可以使用,但薄層色譜所用的硅膠、Al2O3粒度比柱色譜更細。硅膠40

m(一般要求200目左右)

符號:硅膠G硅膠+石膏硅膠H硅膠(未加任何物質)硅膠HF254

硅膠不含粘合劑+熒光物質硅膠GF254

硅膠+石膏+熒光物質

熒光劑：①Mn激活的ZnSiO4（F254），在紫外光（254nm）燈下呈淡綠色熒光②Ag激活ZnS、CuS（F365），呈綠色熒光三.展開劑選擇:(同柱)僅操作方法不同。分離強極性物質,選擇強極性展開劑,同時也應考慮固定相的活性。

物質極性吸附力流動相極性防止大強大太牢,Rf太小小弱小Rf太大分離混合樣品時,展開劑選擇一般規(guī)則:(1)先用單一的中等極性展開劑試一下。(2)改用二元展開劑,其比例要摸索。目的:改變展開劑的極性。圖10-6點滴試驗法例:

A、B兩組分試樣AB展開劑苯Rf0.450.42分不開改為苯+乙醇Rf0.520.46可分開能否說出A、B哪一組分極性大？解：顯然B的極性大。因為展開劑極性加大時,極性大的組分Rf↑(相似相溶)。

此外，為提高分離度、防止斑點拖尾，通常：①分離酸性成分，使用酸性展開劑。②分離堿性物質，使用堿性展開劑。四、操作方法

1.薄層（硬）板的制備

(1)載板的準備多用玻璃板作為載板，也可用塑料膜和金屬鋁箔，要求表面光滑,平整清潔，以便吸附劑能均勻地涂鋪于上。常用規(guī)格有10cm×10cm、10cm×20cm、20cm×20cm等。(2)薄層(硬)板的鋪制

粘合劑煅石膏：吸附劑的9-15%左右羧甲基纖維素鈉CMC-Na：0.5-1%水溶液合成有機物：聚乙烯醇2.5%（有時對顯色劑無效）鋪板方法手工鋪板與機械鋪板各種吸附劑鋪板方法⑴硅膠G⑵硅膠H⑶氧化鋁G（含9%煅石膏）2.點樣點樣體積：一般在1～10

l,

點樣量太大,斑點易拖尾點樣方式：接觸式點樣與噴霧式點樣原點形狀：點狀、條狀點樣器具：微量進樣器、定量毛細管；底距：1.5～2cm點距：0.8～1.5cm原點直徑

：

2～3mm。（邊點邊熱風吹）接觸式點樣應注意：

正確選擇溶解樣品的溶劑,防止點樣環(huán)形色譜效應原點直徑一般以3mm為宜

防止點樣毛細管損傷薄層表面

盡量避免多次點樣

點樣環(huán)形色譜效應：在點樣的同時，樣品在原點呈環(huán)狀展開，如果樣品在溶劑中的溶解度很大，原點將變成空心環(huán)，稱為“點樣環(huán)形色譜效應”?？朔椒?應選擇樣品組分溶解度相對較小的溶劑以避免此現象的產生。噴霧式點樣點樣儀（Linomat5半自動點樣儀）噴霧點樣的優(yōu)點：點樣過程中，點樣器不與薄層板接觸，可防止薄層板表面物理損傷。

能減少樣品橫向、縱向擴散，樣品斑點窄，展開后分離度提高。

自動化程度高，樣品溶液不易在針壁上殘留，可提高點樣的準確度與重現性。3.展開

將點好樣的薄層板浸入展開劑中，展開劑借薄層板上固定相的毛細作用攜帶樣品組分在薄層板上遷移一定距離的過程稱為展開，見圖10-9。（1）展開裝置常用的展開裝置有直立型的單槽色譜缸和雙槽色譜缸（常用其規(guī)格有10cm×10cm、10cm×20cm、20cm×20cm等）、圓形色譜缸、臥式色譜缸等。(2)展開方式

一般展開方式：上行、斜行與下行展開距離：6～15cm注意點：①薄層板浸入展開劑中的深度約0.5cm,不能浸住起始線,層析缸應密閉。②先飽和15～30分鐘,再展開,防止邊緣效應。

邊緣效應是指同一物質的色譜斑點在同一薄層板上出現的兩邊緣部分的Rf值大于中間部分的Rf值的現象。產生該現象的主要原因是由于色譜缸內溶劑蒸氣未達飽和，造成展開劑的蒸發(fā)速率在薄層板兩邊與中間部分不等。展開劑中極性較弱和沸點較低的溶劑在邊緣揮發(fā)的快些，致使邊緣部分的展開劑中極性溶劑比例增大，故Rf值相對變大。a）TLC第一次展開、b）TLC第二次展開、①單向多次展開用同一種展開劑，沿同一展開方向展開多次。通過增加展開距離,達到更好的分離效果特殊展開方式：不同展開距離對結果的影響，硅膠HPTLC分離洋甘菊油，

a）3cm

b）5cm

c）7cm

d）9cm。abcd原點12雙向展開③雙向展開第一次展開后，取出，揮去溶劑，將薄層板旋轉90o角后，再改用另一種展開劑展開。見圖10-11。②單向多級展開用不同的展開劑，沿同一展開方向展開多次。以達到更好的分離效果。

④離心展開——薄層板以適當轉速旋轉時，流動相以適當速率轉移到薄層上。該技術主要用于制備色譜。薄層色譜展開時相對濕度的影響不同相對濕度色譜結果顯示，蒼術在較高濕度條件下分離效果較好。薄層色譜展開時溫度的影響耐用性試驗（Robustness）薄層色譜法變動因素：不同廠牌的薄層板。不同點樣方式。展開溫度及相對濕度的變化等。系指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度。目的為用于常規(guī)檢驗提供依據。4.檢視

1、有色化合物——直接定位2、無色化合物有紫外吸收UV光斑點有熒光熒光板上有暗斑(顯色劑定位)噴霧或浸漬顯色蒸氣顯色：碘-生物堿、氨基酸衍生物、肽類、脂類及皂苷噴霧或浸漬后加熱顯色顯色劑：通用有碘、硫酸不僅有紫外吸收且能產生熒光只有紫外吸收不能產生熒光無紫外吸收(物理定位)五.定性

定性分析方法:將待定性組分與對照品點在同一薄層板上，比較組分與對照品色譜斑點顏色與Rf值的一致性。

對未知樣品,要幾個展開體系均有一致Rf值,才可認為同一物質。

樣對123456溶劑前沿T=23℃RH=62%圖1延胡索薄層色譜鑒別（365nm紫外光燈檢視）1.婦科養(yǎng)坤丸(EEC002)2.婦科養(yǎng)坤丸(EEC001)3.婦科養(yǎng)坤丸(E05005)

4.延胡索對照藥材5.延胡索乙素對照品6.延胡索陰性對照點樣順序從左至右分別為連續(xù)三批供試品、對照藥材、對照品、陰性對照六、定量:

（一）

洗脫法:誤差

5%(基本符合微量分析誤差要求)。薄層分離——取下斑點——洗脫——離心——取上清液進行測定（二）

薄層掃描法:誤差<5%(符合要求)。

薄層掃描法又稱原位定量薄層掃描法（insituquantitativethinlayerchromatography,QTLC）。本法是將一定波長的單色光垂直照射展開后的薄層板，測定薄層色譜斑點的吸收度隨展開距離的變化，所得關系曲線下的面積與色譜斑點中待測物質的濃度或量成正比，這種定量分析方法稱為薄層掃描法。1.基本原理Kubelka-Munk理論由于薄層板上的固定相，對光的散射現象，色譜斑點中待測物質的吸收度與濃度的關系不符合比爾定律。Kubelka-Munk理論充分闡明了薄層色譜斑點中待測物質的吸收度與濃度的定量關系。(克曼方程)設薄層板上固定相的厚度為X,入射光的強度為I0，當透過厚度x的固定相后，照射在微分薄層厚度dx上的入射光強與反射光強分別為i和j時，見圖10-12。其入射光強的增量與反射光強的增量分別符合下面兩個微分方程（10-9）

（10-10）

式中S為薄層單位厚度的散射系數，K為薄層固定相單位厚度的吸光系數.K值與薄層色譜斑點中待測物質的濃度成正比。K雖稱為“吸光系數”，僅因“單位厚度”而得名。將式（10-9）與式（10-10）聯(lián)立求解，可得透過x薄層厚度固定相后的透過光強i及反射光強j與色譜斑點中物質的濃度或量之間的關系（體現在參數a及b中的K）。

（10-11）

（10-12）式中，，

A和B均為常數。在薄層掃描時，我們通常只考慮薄層板的上表面（x=X）反射光的強度j及薄層板的下表面（x=0）透過光的強度i與色譜斑點中的待測物質的濃度或量的關系。圖10-12散射性薄層截面示意圖I0—照射強度；

i(x)-x處的透射光強；j(x)-x處的反射光強；x—固定相層厚（1）薄層色譜斑點的反射率在薄層板的上表面，即

x=X處，I=I0，j=I0R。則

（10-13）式中SX為薄層板的散射參數，它與固定相的種類、粒度及涂布均勻程度有關，其值的大小直接影響到偏離比爾定律的程度。KX為吸收參數，相當于薄層色譜斑點單位面積中待測物質的量()。

當SX一定時(如Merck廠生產的硅膠板SX=3，氧化鋁板SX=7)，R與色譜斑點中待測物質的量（KX）符合上式。（2）薄層色譜斑點的透光率T

在薄層板的下表面，即x=0處，I=I0T，j=0。則

（10-14）

同理，當SX一定時，T與色譜斑點中待測物質的量（KX）符合上式。（3）薄層色譜斑點的吸光度A

理想的空白薄層板的單位薄層厚度的吸光系數K=0。事實上，一般空白板K≠0。為了消除此影響，通常在薄層掃描中都是以空白板為基準，測定相對透光率及相對反射率來計算薄層色譜斑點的吸光度。在透射法中薄層色譜斑點的吸光度為

在反射法中薄層色譜斑點的吸