第二章 基因工程操作常規(guī)技術(shù)2(方)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase

chain

reaction,

PCR）?

PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制

條件，應(yīng)用DNA聚合酶反

應(yīng)，特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。體外程序化的DNA合成技術(shù)。Kary

B.

Mullis2.1.4

基因擴(kuò)增技術(shù)PCR技術(shù)簡(jiǎn)史?DNA的復(fù)制??核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’3’

3’解旋酶解鏈酶

5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)5引物酶PCR技術(shù)簡(jiǎn)史?DNA的復(fù)制??核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)AUCGCGTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGGGAUCG

引物酶

5‘

RNA引物RNA引物TAGCGCTATCGCATCGACGCT

GGAUCGAUCGCGPCR技術(shù)簡(jiǎn)史?DNA的復(fù)制??核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明

DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)3’5‘

5‘3’5’3’

3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC

TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG

ATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術(shù)簡(jiǎn)史

?

DNA的復(fù)制?

核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想?

聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明?

1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA

變性，與合適引物雜交，用DNA聚

合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程

便可克隆基因。?

但由于測(cè)序和引物合成的困難，以

及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克

隆基因成為可能，所以，Khorana

的設(shè)想被人們遺忘了……PCR技術(shù)簡(jiǎn)史?

DNA的復(fù)制

?

核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想

?

聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明?

1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明

了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）?

基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制?

最初采用E-coli

DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該

酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)?

耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)

行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)

化熱循環(huán)儀?

1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)Kary

B.

Mullis<<The

Unusual

Origin

ofthe

Polymerase

Chain

Reaction>>1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR

為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。Mullis開車的時(shí)候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對(duì)面開來的車象是DNA聚合酶，面對(duì)面地合成著DNA……PCR不只是一個(gè)方法改進(jìn)Mullis的上司有句“名言”，“我們要擴(kuò)增這么多DNA樣品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3億美元的轉(zhuǎn)讓費(fèi)將PCR相關(guān)專利轉(zhuǎn)讓給瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的經(jīng)營(yíng)中又獲得了數(shù)億美元的分紅；Mullis于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，PCR和DNA重組技術(shù)一樣意義深遠(yuǎn)。PCR儀器的變遷三個(gè)水浴鍋，用手移動(dòng)（Mullis等人當(dāng)時(shí)用的）電加熱塊＋自來水冷卻（PE，1988）電加熱塊＋內(nèi)置循環(huán)液冷卻（PE，1989）三個(gè)加熱塊＋機(jī)械手（Stratagene，1994）半導(dǎo)體制冷和加熱（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）溫度梯度,熒光檢測(cè)(如Roche的Lightcycler)風(fēng)加熱Lab-on-chip式的PCR儀(所謂的芯片PCR)中國(guó)的狀況1991年出現(xiàn)三個(gè)水浴鍋+機(jī)械手的原始PCR儀（華美，復(fù)日等）現(xiàn)在以半導(dǎo)體（Peltier板）制冷式為主（杭州博日,上海天呈,廈門安普利等）PCR儀721234522時(shí)間（min）

94

溫

度（℃）

55

1

2

3

高溫變性

低溫退火

適溫延伸重復(fù)1-3步25-30輪

目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性形成單鏈

DNA變性子鏈延伸

DNA加倍PCR的基本原理94℃模板DNA50℃

引物1

DNA引物引物272℃引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶94℃

第1輪結(jié)束

第2輪開始50℃

?Taq

?

?

Taq

TaqTaq72℃72℃

第2輪結(jié)束PCR體系的主要組分和反應(yīng)條件

標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物

各200umol/L引物

各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaq

DNA聚合酶

2.5uMg2+

1.5mmol/L1）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ng

DNA模板/100

L。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。(2)引物設(shè)計(jì)：a.序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。b.引物長(zhǎng)度以15-40

bp為宜。c.堿基盡可能隨機(jī)分布，G+C占50-60%。d.引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。e.兩引物間避免有互補(bǔ)序列。f.引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。引物濃度0.1-0.5

mol/L濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermus

aquaticus)0.5-2.5

U/50

l酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。（5）

Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；

Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2）PCR的條件(1)

變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈94℃

20-30s(2)

退火溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。（3）延伸70-75℃，延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯(cuò)誤摻入率增加Reaction

Condition

for

a

Typical

PCR

AssayTypical

PCR

Thermal

Profile*This

cycle

is

normally

included

in

a

PCR

assay

in

order

toallow

any

“unfinished”

product

from

previous

amplification

toachieve

its

full

length

PCR動(dòng)畫1stcycle2ndcycle3rdcycle過程變性引物退火DNA復(fù)制?靈敏度高1.皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平2.

能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞??簡(jiǎn)便、快速

1.一次性加好反應(yīng)液，2～4

小時(shí)完成擴(kuò)增

2.擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低

血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNAPCR的特點(diǎn)PCR的應(yīng)用?

研究–

基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變?

診斷–

細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，診斷?

人類基因組工程–

遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜?

法醫(yī)–

犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析?

腫瘤–

各種腫瘤檢測(cè)?

其他……

1)

基因克隆重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段

2)