膠原在腫瘤腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用

膠原在腫瘤腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤細胞向核電站腫瘤以外的生長過程，也是腫瘤死亡的主要原因之一。因此,闡明腫瘤轉(zhuǎn)移機制并如何阻斷轉(zhuǎn)移過程具有重要意義。腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移必須要求兩個條件:腫瘤血管生成及破壞細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)。在眾多影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的因素中,ECM是阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的第一道屏障,在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中,腫瘤細胞與周圍的外基質(zhì)之間發(fā)生一系列的動態(tài)變化。1般蛋白聚糖protegrange,pgECM是由四大家族構(gòu)成:(1)膠原蛋白(collagen);(2)蛋白聚糖(proteoglycan,PG);(3)彈性蛋白(elastin);(4)細胞外基質(zhì)糖蛋白。1.1不同類型的膠原的分離純化膠原蛋白是ECM的主要組成成分,是由從遺傳學(xué)到分子結(jié)構(gòu)都不同的一組蛋白質(zhì)組成的大家族,分布于幾乎一切組織中。歸屬到膠原家族的蛋白質(zhì)具有自然狀態(tài)結(jié)構(gòu)完整性的功能。根據(jù)外顯子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果,將膠原分為五組:(1)纖維性膠原,包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ型膠原,這些膠原可以在許多組織中形成高度纏繞的纖維;(2)FACIT膠原,包括Ⅸ、Ⅻ、Ⅹ、Ⅳ型膠原,這組膠原的分子往往與纖維性膠原形成的纖維有關(guān);(3)短鏈膠原,由Ⅷ和Ⅹ型膠原組成,這兩種膠原分子都很小,但分布不同,Ⅹ型膠原存在于肥大軟骨中,而Ⅷ型膠原卻廣泛存在于心臟、肝臟、腎臟和肺等組織中;(4)基膜膠原,為Ⅳ型膠原,是基膜的主要組成成分,與基膜的其它成分層粘連蛋白(laminin)、巢蛋白(nidogen)和硫酸肝素蛋白聚糖共同構(gòu)成基膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);(5)其它膠原,包括Ⅵ、Ⅶ及ⅩⅢ型膠原。1.2人體中三種gagPG是一種無處不在的蛋白家族,存在于細胞表面、細胞內(nèi)囊泡、或與ECM結(jié)合。PG分子上的糖鏈為糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG),人體中存在七種GAG:透明質(zhì)酸(hyaluronicacid)、硫酸軟骨素A(chondroitinsulfateA)、硫酸軟骨素C(chondroitinsulfateC)、硫酸皮膚素(dermatansulfate,DS)或硫酸軟骨素B(chondroitinsulfateB)、硫酸角質(zhì)(keratansulfate,KS)、肝素(heparin,HP)及硫酸肝素(heparansulfate,HS)。1.3氧化酶的添加彈性纖維結(jié)構(gòu)復(fù)雜,由彈性蛋白、纖維狀蛋白質(zhì)和賴氨酰氧化酶組成,甚至還含有一定量的蛋白聚糖。彈性蛋白具有獨特的氨基酸組成,酸性和堿性氨基酸含量低,纈氨酸含量高,甘氨酸和脯氨酸各占氨基酸總量的1/3和1/8。1.4維持基膜的相關(guān)蛋白及活性化合物ECM糖蛋白是ECM四大家族中發(fā)展最為迅速的家族,包括非膠原蛋白在內(nèi)的諸種ECM糖蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)的有十余種,為層粘連蛋白(laminin,LN)、纖連蛋白(fibronectin,FN)、Jt蛋白、巢蛋白(nidogen)、osteopontin、聚集蛋白(agrin)、黏蛋白(mucin)、restrictin、osteonectin、生腱蛋白(tenascin)、thrombospondin等。LN及其相關(guān)蛋白對維持基膜的正常功能起重要作用,參與細胞吸附、遷移、生長和分化。FN分子上的不同部位可以與膠原、肝素、硫酸肝素及細胞血纖蛋白結(jié)合,這種結(jié)合是FN活躍生物功能的分子基礎(chǔ)。FN可以增進細胞黏著、影響細胞遷移及分化、參與細胞骨架構(gòu)建及細胞形態(tài)的形成。osteopontin(OPN)存在于乳汁、骨骼、腎、子宮及蛻膜中,OPN通過RGD序列依賴性和非RGD序列依賴性途徑與細胞和ECM相互作用,與腫瘤轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系日益受到重視。2腫瘤細胞的黏附及降解Liotta提出的腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移的三步驟假說仍被廣為接受。該過程從分子水平上可以分為3個階段:腫瘤細胞之間的解黏附和腫瘤細胞與ECM之間的黏附;ECM的降解:腫瘤細胞和宿主細胞分泌的蛋白水解酶,使腫瘤細胞周圍的ECM發(fā)生降解;運動:腫瘤細胞被生長因子及趨化因子誘導(dǎo),向縱深運動。此過程反復(fù)連續(xù)進行,宏觀結(jié)果即表現(xiàn)為腫瘤細胞向外擴展、侵襲。3腫瘤轉(zhuǎn)移、細胞外基質(zhì)和基底膜3.1蛋白家族和跨膜蛋白質(zhì)家族的基因組織轉(zhuǎn)移過程中首先是細胞黏著特性的改變,細胞間黏著分子改變了腫瘤細胞和ECM以及間質(zhì)細胞之間的結(jié)合。涉及到腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的細胞黏著分子(celladhesionmolecule,CAM)根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能特征分屬于以下幾個基因家族:鈣黏著蛋白家族(cadherins)、整聯(lián)蛋白(integrins)家族、免疫球蛋白大家族(immunoglobulinsuperfamily)、選擇蛋白家族和透明質(zhì)酸受體家族。所有這些均為跨膜蛋白質(zhì)。鈣黏著蛋白由多個家族成員組成,根據(jù)組織分布的不同分為E、P、N、V、M等多種亞型,利用其胞外結(jié)構(gòu)序列來識別和介導(dǎo)同種細胞間的黏著反應(yīng)。整聯(lián)蛋白及其家族在人體各組織中表達,它介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的反應(yīng),參與細胞信號傳遞、細胞黏著、遷移,控制細胞分化、增殖以及凋亡等各種生理過程。免疫球蛋白大家族的CAM介導(dǎo)非離子依賴的同嗜性和異嗜性相互作用,同時也是整聯(lián)蛋白及ECM蛋白的受體。透明質(zhì)酸受體是一種多功能的細胞表面跨膜蛋白質(zhì),主要與ECM中的透明質(zhì)酸結(jié)合,也能與膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白等結(jié)合,參與細胞和基質(zhì)的黏著。3.2ecm及細胞間黏著蛋白的酶對腫瘤微環(huán)境的研究表明,它們也參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,而以往研究往往將焦點集中于腫瘤細胞本身的特性上,忽略了微環(huán)境的影響。腫瘤周圍微環(huán)境包括纖維細胞、內(nèi)皮細胞、免疫細胞及ECM。腫瘤細胞降解基質(zhì)蛋白是局部侵襲和轉(zhuǎn)移的必需步驟,而降解的基質(zhì)蛋白對腫瘤細胞的生長增殖有幫助。降解ECM和細胞之間黏著蛋白的酶主要有以下幾種:基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP);組織絲氨酸蛋白水解酶,包括尿激酶型纖溶酶原激活系統(tǒng)(urokinase-typeplasminogenactivatorsystem,u-PA)、纖溶酶、凝血酶等;ADAM(adamalysin-relatedmembraneproteases)家族分子;骨形態(tài)發(fā)生蛋白1型金屬蛋白酶(BMP-1-typemetalloproteinase);乙酰肝素酶(heparanase);組織蛋白酶(cathepsin)。以下分述研究較多的與ECM相關(guān)的腫瘤轉(zhuǎn)移因素。3.2.1mmp治療腫瘤細胞級在腫瘤侵襲過程中,腫瘤細胞首先與基底膜表面受體如纖連蛋白(FN)和層粘連蛋白(LN)結(jié)合,然后分泌MMP等降解酶或誘導(dǎo)基質(zhì)細胞分泌酶類,降解基底膜和基質(zhì),最終腫瘤細胞沿基底膜缺損和基質(zhì)空隙向周圍生長。MMP主要以3種機制促進腫瘤細胞的侵襲生長:(1)蛋白酶作用使得腫瘤細胞周圍由基質(zhì)分子如膠原、LN、FN等形成的物理屏障被破壞;(2)MMP可以重塑細胞間黏附力,以便腫瘤細胞向周圍生長;(3)MMP作用于基質(zhì)成分后,激發(fā)其他一些潛在的生物活動,如MMP-2分解LN-5后可產(chǎn)生具催化作用的可溶性片段,參與腫瘤的免疫過程。因此,MMP活性上調(diào)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。3.2.2纖溶酶原pa已經(jīng)證明在許多腫瘤中,u-PA和它的調(diào)節(jié)系統(tǒng)參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移。u-PA主要通過結(jié)合位于細胞表面的u-PA受體發(fā)揮作用,兩者結(jié)合后,u-PA能夠水解剪切無活性的絲氨酸纖溶酶原,將其轉(zhuǎn)變成有活性的纖溶酶,纖溶酶能降解ECM蛋白,包括纖連蛋白、透明玻連蛋白(vitronectin),層粘連蛋白、纖維蛋白、纖溶酶原激活膠原酶前體。u-PA和纖溶酶還能激活許多生長因子前體分子,包括SF/HGF、bFGF、TGF-等。u-PA的活性受纖溶酶原激活抑制劑PAI-1、PAI-2的調(diào)控。在許多腫瘤,包括肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌和前列腺癌中都有u-PA及相應(yīng)調(diào)節(jié)分子的高表達,并且與腫瘤的預(yù)后、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。3.2.3促進血管生成硫酸乙酰肝素聚糖(heparansulfateproteoglycan,HSPG)是在機體中廣泛存在的生物大分子,在維持組織的屏障、維持ECM及許多生物分子穩(wěn)定性中發(fā)揮作用。它也是許多生物分子與細胞表面以及ECM結(jié)合的橋梁。乙酰肝素酶對硫酸乙酰肝素的剪切影響了組織的完整性和功能,導(dǎo)致腫瘤細胞在變化的微環(huán)境中發(fā)生遷移。乙酰肝素酶是哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的第一個能降解硫酸乙酰肝素分子的酶,主要表達于腫瘤細胞和腫瘤病灶中,并且與許多腫瘤的轉(zhuǎn)移表型密切相關(guān),這些腫瘤包括前列腺癌、膽囊癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等。乙酰肝素酶的另一個功能是促進血管生成因子釋放進ECM,加速腫瘤內(nèi)血管的生成。無轉(zhuǎn)移能力的細胞株轉(zhuǎn)化乙酰肝素酶后能獲得轉(zhuǎn)移能力,而抑制乙酰肝素酶的活性就能減少實驗動物發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的概率。有文獻報道通過的基因轉(zhuǎn)染實驗獲得了HPA促進腫瘤轉(zhuǎn)移最直接的證據(jù)。他們通過載體將HPA分別導(dǎo)入無轉(zhuǎn)移潛力的小鼠淋巴瘤細胞系和低轉(zhuǎn)移潛力的黑素瘤細胞系,結(jié)果轉(zhuǎn)染細胞均有高水平HPA表達,并獲得高轉(zhuǎn)移潛能,經(jīng)裸鼠靜脈接種后大體標(biāo)本和顯微鏡檢均發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組有明顯肝轉(zhuǎn)移灶。陳曉鵬等用含人全長乙酰肝素酶cDNA的pcDNA3-HPA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株,用侵襲小室觀察肝癌細胞穿膜細胞數(shù)。證明普通無侵襲轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染HPAcDNA后可以獲得較高侵襲轉(zhuǎn)移能力,同時也證明了HPA具有促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的特性。王順祥等設(shè)計合成互補于HpAmRNA起始密碼區(qū)的反義寡核苷酸(AS-ODN),以陽離子脂質(zhì)體oligofectamineTMreagent包埋后轉(zhuǎn)染BEL-7402細胞。以基底膜重建實驗檢測細胞侵襲力的變化。結(jié)果顯示一定濃度的HPAAS-ODN可通過下調(diào)HPAmRNA和蛋白的表達抑制肝癌細胞的侵襲力。Chen等將無義寡核苷酸(N-ODN)和5條相對于HPAmRNA不同部位的AS-ODN轉(zhuǎn)入食管癌EC9706細胞,結(jié)果表明AS-ODN可以抑制HPAmRNA的表達,AS-ODN和N-ODN間有顯著的差異,而AS-ODN間差異不明顯,從而指出AS-ODN能顯著抑制食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移。Ogishima等用EGR1siRNA轉(zhuǎn)染T24膀胱癌細胞株后相對于對照組siRNA轉(zhuǎn)染明顯下調(diào)HPA表達。Yang等也證實,反義介導(dǎo)的HPA活性抑制能顯著降低結(jié)腸癌LS-174T細胞的侵襲能力。3.2.4腫瘤細胞前轉(zhuǎn)移臨床研究較多的是組織蛋白酶B,近年的體外實驗發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B可以降解纖連蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅳ型膠原蛋白和層粘連蛋白等ECM成分,而且諸多實驗證實組織蛋白酶分布在腫瘤細胞外圍,且可以激活能夠降解ECM的尿激酶型纖溶酶原激活物、MMP等。因此認為組織蛋白酶B在腫瘤細胞向深部組織浸潤和遠處轉(zhuǎn)移的過程中起重要作用。利用原位雜交技術(shù)、蛋白質(zhì)印跡法及免疫組化等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤組織中,組織蛋白酶B的表達及其活性均成倍甚至3-9倍高于鄰近正常組織,并且在結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn),組織蛋白酶B過表達在腫瘤侵襲邊緣最為顯著,細胞周圍基質(zhì)染色明顯,且組織蛋白酶的表達水平與腫瘤的大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。這些現(xiàn)象均提示組織蛋白酶可能與腫瘤侵襲有關(guān)。另外,腫瘤血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生蛋白水解酶,在腫瘤血管生成過程中起重要作用?，F(xiàn)認為,腫瘤間質(zhì)內(nèi)毛細血管及成纖維細胞分泌組織蛋白酶,可降解血管基底膜和ECM,有利于血管內(nèi)皮細胞的遷移,從而促進腫瘤新生血管的形成,血管生成的增加和組織蛋白酶B的過表達明顯相關(guān),血管密度較高與區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。4新血管生成藥物侵襲和轉(zhuǎn)移雖然是惡性腫瘤最基本的特征,但脈管系統(tǒng)在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移方面有著重要的作用。在沒有新血管生成以前,腫瘤只生長到1-2mm3,不會發(fā)生轉(zhuǎn)移;而在新血管生成后腫瘤成數(shù)倍增長,轉(zhuǎn)移機會隨之增高。而近年來也有大量的實驗研究表明,淋巴管生成在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起著不容忽視的作用。所以聯(lián)合研究腫瘤的血管生成和淋巴管生成在腫瘤的防治中有重要意義。4.1血管生成機制腫瘤血管生成是指從已存在的血管床中產(chǎn)生出新生血管系統(tǒng),包括血管內(nèi)皮細胞增殖、繼續(xù)增殖提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),受控于多種血管生成因子。正常的血管生成被嚴格控制于某些暫定的、特定的生理過程,如生殖過程、發(fā)育過程和傷口愈合過程,而持續(xù)的血管生成是某些病理改變?nèi)缒[瘤生長的特性。事實上,血管生成不但是腫瘤生長所必需的,而且腫瘤細胞與新生血管系統(tǒng)的接觸還是導(dǎo)致遠處轉(zhuǎn)移的原因。腫瘤血管生成是一個連續(xù)的過程,其主要步驟如下:腫瘤血管內(nèi)皮細胞釋放出多種血管生成因子;血管內(nèi)皮細胞(EC)因血管生成因子的作用而出現(xiàn)形態(tài)改變,包括各種細胞器數(shù)目和大小的增加以及偽足的出現(xiàn);EC和腫瘤細胞釋放蛋白酶以降解毛細血管基底膜和周圍ECM,繼而引起ECM重塑;EC從毛細血管后微靜脈遷徙出來形成血管新芽;EC增殖;腫瘤微血管分化和成型。4.2淋巴管更新的基礎(chǔ)淋巴管作為血管系統(tǒng)的補充,形成了一個循環(huán)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng);淋巴管網(wǎng)由樹樣結(jié)構(gòu)的脈管構(gòu)成,它收集組織液、代謝產(chǎn)物、從毛細血管中漏出的大分子以及細胞成分,并將其轉(zhuǎn)運回血液循環(huán)。淋巴管不但起著維持正常組織液的平衡和機體的免疫監(jiān)視作用,而且為許多惡性腫瘤提供了轉(zhuǎn)移的通道。臨床病理學(xué)證實,實體腫瘤最早是通過淋巴管通路播散至局部淋巴結(jié)的。淋巴管的生成是指新的淋巴管的形成。目前已知許多疾病的關(guān)鍵病理進程均涉及到淋巴管生成,尤其是惡性腫瘤的播散過程。近年來,隨著促淋巴管生成因子如血管內(nèi)皮生長因子-C(vascularendothelialgrowthfactor-C,VEGF-C),VEGF-D和淋巴管內(nèi)皮細胞特異性標(biāo)志如血管內(nèi)皮生長因子受體-3(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-3,VEGFR-3)、淋巴管透明質(zhì)酸酶受體-1和Prox-1等的相繼發(fā)現(xiàn),以及在動物實驗和臨床病理研究中廣泛應(yīng)用,淋巴管生成因子在腫瘤淋巴管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移中作用