分子生物學(xué)實驗技術(shù)

《分子生物學(xué)實驗技術(shù)》實驗報告實驗一堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA實驗原理在堿性環(huán)境中，細(xì)菌膜破裂釋放內(nèi)容物。染色體DNA變性分開，而質(zhì)粒DNA雖變性但仍處于纏繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，最后用酚、氯仿抽提純化得到質(zhì)粒DNA。操作步驟主要步驟1.細(xì)菌的培養(yǎng)2.細(xì)菌的收集和裂解3.質(zhì)粒DNA的分離和純化4.質(zhì)粒的鑒定具體操作如下：1.取1.5ml過夜菌液于EP管中，12000r/min離心1min，棄去上清液。2.加100μl溶液Ⅰ，劇烈震蕩使菌體懸浮均勻，室溫放置5min。3.加200μl溶液Ⅱ（現(xiàn)配現(xiàn)用），輕柔顛倒混勻4~6次，室溫放置5min。4.加150μl預(yù)冷溶液Ⅲ，輕柔顛倒混勻4~6次，冰上放置10分鐘。5.12000r/m離心10分鐘(如果上清液仍然渾濁，可將上清液移出，再次離心5分鐘）。6.吸出上清液，加2.5倍體積的無水乙醇，混勻，室溫放置10分鐘，12000r/min離心10分鐘，沉淀DNA。7.棄上清，揮干，所得DNA溶于30μlddH2O中，用于后續(xù)試驗。三、實驗結(jié)果獲取極少量白色固體，主要為DNA，也不排除有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，但是不影響后續(xù)實驗的繼續(xù)進(jìn)行。實驗二氯化鈣法進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及篩選實驗原理細(xì)菌處于0℃，在CaCl2低滲溶液中，菌體細(xì)胞膨脹成球形，DNA則與CaCl2形成抗Dnase的羥基－磷酸鈣復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，重組子的基因在被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。1.氯化鈣（二價鈣離子）的作用：提高細(xì)胞壁（膜）的通透性。2.熱激后迅速轉(zhuǎn)移到冰上：促使質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入胞內(nèi)。3.這種轉(zhuǎn)化方法適用于雙鏈環(huán)狀DNA（質(zhì)粒），線型DNA不能采用此法。（在自然界自然發(fā)生的轉(zhuǎn)化過程中，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞中的為單鏈DNA）。二、試驗方法1.感受態(tài)的制備（1）將大腸桿菌DH5α在LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)16~20hr（或過夜）。（2）從平板上挑取一個2~3mm大小的單菌落移至2~5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃強烈振蕩過夜。（3）取1個三角瓶將菌液按1︰100稀釋接種，37℃強烈振蕩培養(yǎng)3hr，此時細(xì)菌OD600=0.4~0.6,為對數(shù)生長期。（4）將培養(yǎng)物置冰上10min后轉(zhuǎn)移置離心管中,4000rpm,4℃離心5min。（5）棄上清，加入10ml(50ml原培養(yǎng)物)冰浴冷的0.1MCaCl2溶液,致敏懸浮細(xì)胞，置于冰上10min。（6）4000rpm,4℃離心5min回收細(xì)胞，棄上清，每50ml原培養(yǎng)物再加入2ml冰冷的0.1MCaCl2溶液，懸浮細(xì)胞。（7）按每份200ul分裝細(xì)胞，若不24小時內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,可在感受態(tài)細(xì)胞中加入終濃度為10%的滅菌甘油,置于-70℃冰箱保存。重復(fù)5-6的操作，以使反應(yīng)更完全，增加成功率。2.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（1）加10μl質(zhì)粒DNA溶液至100μl感受態(tài)細(xì)胞中，溫和混勻，置于冰上20min。（2）42℃熱沖擊90s，迅速放回冰上，將細(xì)胞冷卻2~3min，加入500μlLB培養(yǎng)基。（3）將轉(zhuǎn)化后細(xì)菌放置37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)45min，讓細(xì)菌中的質(zhì)粒表達(dá)抗生素抗性蛋白。3.涂板篩選（1）取100μl轉(zhuǎn)化混合物鋪于LB+Amp（含有誘導(dǎo)物IPTG及生色底物X-gal）平板上，室溫放置至液體被瓊脂全部吸收，倒置平板于37℃培養(yǎng)12~16h(過夜)。（2）取出平板，觀察平板上菌落的顏色和形狀，挑選白色克隆進(jìn)行PCR和質(zhì)粒酶切驗證。三、實驗結(jié)果平板上可見分布不均勻的藍(lán)色菌落。四、討論含重組體的Puc18為白色菌落，含載體的puc18為藍(lán)色菌落。若全為藍(lán)色菌落，說明實驗中治理的轉(zhuǎn)化和篩選成功，如果有藍(lán)白菌落混合，則說明實驗失敗。實驗三全血DNA的提取及電泳一、實驗原理由于血液各組分成分顆粒大小及比重不同，利用明膠的吸附作用，使紅細(xì)胞沉積在管底，從而與白細(xì)胞相分離。通過SDS的破膜（細(xì)胞膜和核膜）作用，使白細(xì)胞釋放出DNA。然后利用酚和氯仿抽提純化，分離去除蛋白質(zhì)。最后用乙醇沉淀洗出DNA。二、操作步驟1．分離WBC取1ml全血與明膠等體積混合，顛倒混勻，37℃靜置5-10min，取上清液，4000r/min離心5min，然后棄去上清液。2．破碎WBC加入2mlTES,輕輕敲擊管底震蕩混勻，加入10滴10%SDS，顛倒混勻。3.抽提DNA加等體積Tris飽和酚,顛倒混勻100次，4000rpm離心5min,取上清液，加等體積氯仿：異戊醇（24:1），顛倒混勻100次，4000rpm離心5min，將上清移入玻璃試管。4.沉淀DNA加2.5倍體積無水乙醇，吸出絮狀沉淀到1.5mlEP管，開蓋通風(fēng)櫥內(nèi)放置5min，揮干至無殘余液體，加入100μ?ddH2O溶解。實驗結(jié)果四、討論1.左邊的孔加的是擴增的PCR的產(chǎn)物，可見在最靠近孔處有一條帶，是對應(yīng)的產(chǎn)物。相鄰的另一條帶是擴增的質(zhì)粒。（實驗四的結(jié)果）2.第二個孔板里加的是全血DNA,所以可以看到DNA。實驗四PCR-SSCP法檢測人肥胖基因的點突變一、基本原理在微量離心管中，加入適量的緩沖液，模板DNA，dNTPs，TaqDNA聚合酶，引物，以高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個反應(yīng)為一個循環(huán)，經(jīng)過25~35次循環(huán)，最終使特異區(qū)段的DNA擴增數(shù)百萬倍，滿足分子生物學(xué)下游操作。二、實驗方法1.PCR擴增靶DNA;2.將特異的PCR擴增產(chǎn)物變性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子;3.進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳;4.最后通過銀染顯色分析結(jié)果。三、實驗結(jié)果四、討論（1）如圖所示，