黃連中5種生物堿含量測定的方法學考察

黃連中5種生物堿含量測定的方法學考察

黃連是常用的臨床藥物，而香連是其主要品種。目前黃連藥材、飲片和成方制劑的質量控制主要以單指標(小檗堿)來控制其質量。小檗堿已知在很多植物中均存在,且含量較高,如三顆針、黃柏等,因此選擇適宜的指標對于保證黃連及其相關成藥的質量至關重要。生物堿是黃連的主要有效成分,除小檗堿之外,還含有巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿等含量較高的成分,特別是表小檗堿是甄別黃連與其他摻假品的特征性成分;因此選取小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿等5個成分作為指標評價黃連的質量是恰當?shù)?。文獻調研發(fā)現(xiàn),已有測定黃連中這5個生物堿含量的報道,但這些文獻所報道的方法無法在實際工作中應用,其無法逾越的瓶頸就是缺乏其中的一些對照品,尤其是表小檗堿(純化難度極大)和黃連堿,直接限制了用常規(guī)的外標或內標法來實現(xiàn)其多指標質量控制的設想。為此,我們提出一測多評法(QAMS)以克服多指標質量控制中的這一難題;即只測定其中一個成分(如小檗堿),通過確定它與其余待測成分(巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿)間的內在函數(shù)關系,建立其QAMS的多指標質量控制方法;在方法實施時,可僅有一個對照品(小檗堿)而其余對照品缺省的情況下,實現(xiàn)這些成分的同步含量測定。本實驗將以黃連為研究對象,考察生物堿類成分間相關關系的適應性,以驗證QAMS在黃連多指標質量控制中應用的技術可行性。1試劑:agitynt創(chuàng)造-csWaters1515-2487-717高效液相色譜系統(tǒng),Empower工作站(Waters公司),Agilent1100高效液相系統(tǒng),Agilentchemstation工作站;AlltimaC18(4.6mm×250mm,5μm),AgilentExtend-C18(4.6mm×250mm,5μm),ZorbaxSB-C18(4.6mm×250mm,5μm),KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm);KQ-100超聲儀(40kW),乙腈、甲醇為色譜純,水為高純水,其余試劑均為分析純。鹽酸藥根堿(0733-20005)、鹽酸巴馬汀(110732-200506)和鹽酸小檗堿(110733-200609)均購自中國藥品生物制品檢定所,鹽酸黃連堿和鹽酸表小檗堿為自制,HPLC(峰面積歸一化法)純度為98%。黃連藥材和飲片采或購自四川、山西、廣州等地,經(jīng)本所生藥室何希榮主管技師鑒定為黃連CoptischinensisFranch.的干燥根。2分析和結果2.11個研究和多評價理論的研究2.1.1zorbaxbs-s18kromasil18,kromasil18kh3po4-1,3.色譜柱為AlltimaC18(4.6mm×250mm,5μm),AgilentExtend-C18(4.6mm×250mm,5μm),ZorbaxSB-C18(4.6mm×250mm,5μm),KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)。流動相為乙腈-水(50∶50),其中加入50mmol·L-1磷酸二氫鉀(KH2PO4),25mmol·L-1十二烷基磺酸鈉(SDS),調節(jié)pH3,柱溫30℃,流速0.6mL·min-1,檢測波長345nm。上述色譜條件下,各組分分離度良好,見圖1。2.1.2對照品溶液的制備取鹽酸藥根堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿以上5種生物堿,精密稱定,分別為6.36,7.40,15.53,10.92,45.26mg分別置于10mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,精密移取上述5個對照品溶液各1mL,置于50mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,為混標溶液。將上述混標保存于4℃冰箱中,備用。2.1.3液-液法測定總甲醇-鹽酸-甲醇-鹽酸分光光度法取黃連藥材粉末(過40目篩)約0.1g,精密稱定,置于50mL錐形瓶,精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)的混合液50mL,稱重,超聲30min,冷卻后加甲醇-鹽酸(100∶1)的混合液補足重量,過濾,取續(xù)濾液過0.45μm濾膜,5μL進樣。2.1.4進樣分析精密吸取上述混合對照品溶液40,30,20,10,8,6,4,2,1μL,進樣分析,每個濃度進樣3次,取平均值。以進樣量對峰面積積分值進行回歸處理,得藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的標準曲線見表1。2.1.5根堿、小堿、麻黃堿、配比以小檗堿為內標,計算小檗堿(berberine,簡稱B)對藥根堿(jatrorrhizine,簡稱J)、表小檗堿(epiberberine,簡稱E)、黃連堿(coptisine,簡稱C)、巴馬汀(palmatine,簡稱P)的校正因子,見表2。2.1.6精密度實驗2.1.7小堿、類堿穩(wěn)定性研究精密吸取同一供試品溶液5μL分別于配制后的0,2,4,8,12,24,48,72h測定面積積分值,藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿穩(wěn)定性的RSD分別為1.1%,0.85%,0.95%,2.1%,和1.2%。表明處理后的樣品在3d內穩(wěn)定。2.1.8平均含量測定稱取黃連(產地廣州)藥材粉末(40目)約0.1g共6份,精密稱定,按“2.1.3”項下制備樣品,測定藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的平均含量分別為6.44,7.55,14.7,11.6和47.5mg·g-1,RSD分別為2.0%,2.1%,2.4%,3.0%和2.8%。2.1.9加樣回收率和精密度精密稱取適量已知含量的黃連藥材粉末(60目)6份,加入一定量的“2.1.2”項下(藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿)對照品溶液各1mL,甲醇-鹽酸(100∶1)的混合液45mL,按“2.1.3”項下制備樣品,測定,計算加樣回收率,藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的加樣回收率分別為101.0%,100.6%,99.46%,101.6%和103.7%,RSD分別為2.5%,1.6%,1.8%,2.5%和1.2%。2.2重建因素的再現(xiàn)研究2.2.1堿和民法汀的校正因子取“2.1.2”項下混合對照品溶液,進樣20,10,8,6,4,2,1μL測定,按“2.1.5”項下計算小檗堿對藥根堿、表小檗堿、黃連堿和巴馬汀的校正因子。實驗考察了Waters1515-2487-717,Agilent1100兩種高效液相色譜系統(tǒng),AlltimaC18(4.6mm×250mm,5μm),AgilentExtend-C18(4.6mm×250mm,5μm),ZorbaxSB-C18(4.6mm×250mm,5μm),KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)4種色譜柱,結果見表3。2.2.2實驗室研究建立的一測多評實驗方法在經(jīng)兩個實驗室進行復核實驗ZorbaxSB-C18(4.6mm×250mm,5μm),結果見表4。2.2.3峰位置判斷結果利用相對保留值定位:知道內參物的保留時間,加上相對保留值,再根據(jù)峰形判斷,即能夠正確判斷出目標峰的準確峰位置,結果見表5。由表5可知,RSD≤5%,表明利用RTR進行峰的定位是可行的。2.3cams含量測定分別精密吸取供試品溶液各5μL注入高效液相色譜儀,測定。采用外標兩點法和一測多評法計算黃連藥材中藥根堿、表小檗堿、黃連堿和巴馬汀的含量,結果見表6。為確認QAMS的準確性,我們用外標法進行比較。兩法所得到的含量值之間用Pearson相關系數(shù)進行比較,分別為0.999961,0.999971,0.999992和0.999973,說明兩法得到的含量的相似性極高;再從其含量間的相對誤差來看,亦在3%以內;表明兩種含量測定方法得到的含量值之間無顯著性差異,說明QAMS在黃連的多指標成分質量評價中應用是可行的。3實驗結果分析精密吸取同一供試品溶液5μL于同一天內連續(xù)進樣5次,記錄藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的峰面積,得出日內精密度分別為0.98%,0.65%,0.83%,1.5%和1.2%;精密吸取同一供試品溶液5μL連續(xù)進樣3d,每天3次,記錄峰面積,以上5個生物堿成分的日間精密度分別為1.3%,1.6%,2.1%,3.0%和2.4%。表明儀器較為穩(wěn)定。3.1本實驗選用甲醇、乙醇和丙酮3種不同提取溶劑,加酸與不加酸以及酸的用量,超聲、回流和回流后再超聲等不同提取方法,用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑萃取對提取效率的影響。最后得出結論:用甲醇-鹽酸(100∶1)超聲最為簡單,且能將藥材中的生物堿提取完全。3.2本實驗選用小檗堿為內參物進行QAMS的理由是:小檗堿為黃連中主要藥效成分,且定量用對照品價廉易得。3.3建立小檗堿與其余4種成分間的相對校正因子的評價中,我們考察了不同色譜柱、液相色譜系統(tǒng)和實驗室的影響,結果表明,QAMS與外標法得到的含量值之間沒有顯著性差異,說明建立的校正因子具有較好的可信度,QAMS可以在對照品缺省的情況下實現(xiàn)其定量。3.4用內標峰的保留時間,加上RTR,再根據(jù)峰形判