垃圾滲瀝液處理中微生物群落的菲厭氧降解

垃圾滲瀝液處理中微生物群落的菲厭氧降解

衛(wèi)生填埋是我國(guó)城市生活垃圾處理的主要途徑。由于中國(guó)衛(wèi)生填埋技術(shù)的局限性，中國(guó)目前還沒(méi)有達(dá)到污染控制標(biāo)準(zhǔn)。為了避免局部滲透過(guò)程中的土壤和地下水，因此很難避免垃圾滲濾過(guò)程中的有機(jī)污染物。此外，垃圾滲濾中的有機(jī)污染物含量很高，導(dǎo)致土壤和地下水的嚴(yán)重污染，地下水中的污染物容易形成厭氧環(huán)境。垃圾滲濾液中通常含有高濃度的多環(huán)芳烴,而垃圾填埋場(chǎng)周?chē)鷧^(qū)域的地下水中多環(huán)芳烴污染往往十分嚴(yán)重,濃度甚至高達(dá)7.1~12.6mg/L。多環(huán)芳烴具有潛在的致畸性、致癌性和基因毒性,嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境和人類健康,已被我國(guó)和其他許多國(guó)家列為優(yōu)先控制的環(huán)境污染物。土壤中多環(huán)芳烴的去除有物理、化學(xué)和生物等方法,其中生物修復(fù)的方法有著成本低、效果好的優(yōu)點(diǎn),得到了廣泛的應(yīng)用。生物修復(fù)是利用微生物清除污染土壤的方法,因而是適合去除多環(huán)芳烴的環(huán)境友好技術(shù)。多環(huán)芳烴降解過(guò)程中微生物群落的變化信息對(duì)于生物修復(fù)技術(shù)的成功開(kāi)發(fā)是十分關(guān)鍵的然而目前對(duì)于受垃圾滲濾液污染土壤或地下水中微生物群落以及其在多環(huán)芳烴降解過(guò)程中的變化尚缺乏信息。末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism,TRFLP)是目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較多的一種新型分子指紋分析方法,Liu等首先將TRFLP技術(shù)應(yīng)用于微生物群落分析中,為分析和比較環(huán)境樣品微生物群落結(jié)構(gòu)的組成提供了新的手段。TRFLP技術(shù)在國(guó)外已經(jīng)被大量應(yīng)用于環(huán)境研究領(lǐng)域,如污水處理系統(tǒng)中微生物群落分析、飲用水的安全性評(píng)價(jià)、天然土壤微生物群落的多樣性、污染物對(duì)土壤或沉積物微生物群落的影響等。然而,目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)應(yīng)用TRFLP技術(shù)監(jiān)測(cè)地下含水層沉積物中微生物群落的研究報(bào)道極少,僅Wood使用TRFLP技術(shù)考察了生物修復(fù)過(guò)程中受三氯乙烯污染的地下含水層內(nèi)微生物群落的變化。此外,到目前為止,被報(bào)道用于研究多環(huán)芳烴污染環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其變化的分子生物學(xué)技術(shù)只有變性梯度凝膠電泳技術(shù)(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)及磷酯脂肪酸分析技術(shù)(phospholipidfattyacid,PLFA)。本文主要利用TRFLP技術(shù)研究受垃圾滲濾液污染的地下沉積物中微生物群落及在菲(一種常見(jiàn)多環(huán)芳烴)厭氧降解條件下的變化,為多環(huán)芳烴的厭氧修復(fù)提供一定的微生物學(xué)參考。1試驗(yàn)材料和方法1.1模擬裝置的建立將采集到的受垃圾滲濾液污染的地下沉積物放在通風(fēng)處自然晾干,然后過(guò)80目(孔徑0.2mm)篩,裝入塑封袋,于4℃冰箱儲(chǔ)存。產(chǎn)甲烷條件下的培養(yǎng)液配制及模擬裝置建立方法如文獻(xiàn)所述。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立一系列厭氧(產(chǎn)甲烷條件)降解模擬裝置和滅菌對(duì)照實(shí)驗(yàn)的模擬裝置。厭氧降解模擬裝置建立方法簡(jiǎn)述如下:在50mL血清瓶中加入2g干燥的沉積物和400μL菲的丙酮儲(chǔ)備液(500mg/L),待丙酮揮發(fā)完全后,加入10mL的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液(水土比為5:1),以氮?dú)獯得撗迤坷锩娴目諝?最后密封瓶蓋。滅菌對(duì)照實(shí)驗(yàn)的模擬裝置建立方法簡(jiǎn)述如下:在50mL血清瓶中加入2g干燥的沉積物,用蒸汽滅菌鍋在121℃下連續(xù)滅菌3次,每次0.5h。滅菌結(jié)束后,待溶液冷卻至室溫,加入400μL菲的丙酮儲(chǔ)備液,待丙酮揮發(fā)完全后,加入10mL的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液(水土比為5:1),以氮?dú)獯得撗迤坷锩娴目諝?最后密封瓶蓋。將全部降解試驗(yàn)與滅菌對(duì)照試驗(yàn)置于空氣浴恒溫?fù)u床中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為25℃,100rpm。1.2高效液相色譜條件將水-沉積物的混合物轉(zhuǎn)移到100mL離心管離心10min(5000rpm)去除上清液,采取文獻(xiàn)的改進(jìn)方法萃取干燥沉積物中的菲,萃取方法簡(jiǎn)述如下:10mL丙酮超聲萃取3次,然后混合物離心10min(5000rpm)分離萃取液,取200μL萃取液,甲醇稀釋5倍,用0.45μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾后上HPLC檢測(cè)。試驗(yàn)采用的HPLC條件如下:色譜柱為VenusiMP-C18(4.6mm×250mm;5μm),流動(dòng)相采用甲醇和水(90/10),流速1mL/min,進(jìn)樣量10μL,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。該方法下菲的平均回收率為93.7%。1.3細(xì)菌16srdna片段的擴(kuò)增和酶切鑒定采用MobioLaboratories的UltraClean土壤DNA提取試劑盒提取樣品DNA,方法參照試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。提取的DNA放于–20℃保存以待后續(xù)的微生物學(xué)分析。在TRFLP分析中,采用細(xì)菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)對(duì)細(xì)菌16SrDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。采用FAM熒光素標(biāo)記正向引物27F的5’端。采用50μL的PCR反應(yīng)體系:25μL2×TaqPCRMasterMix(天根公司);2μL正反引物(賽百盛公司);8μLDNA模板;13μL超純水。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸90s,共30個(gè)循環(huán);最終72℃延伸10min;4℃保存。此外,還采用古細(xì)菌引物A109F(5’-ACKGCTCAGTAACACGT-3’)和A934R(5’-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3’)對(duì)古細(xì)菌16SrDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。采用FAM熒光素標(biāo)記正向引物A934R的3端。PCR反應(yīng)體系同上,反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性60s,52℃退火60s,72℃延伸90s共38個(gè)循環(huán);最終72℃延伸6min;4℃保存。按照德國(guó)QIAquickPCRpurificationkit(QiagenInc.)的操作步驟純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,用限制性內(nèi)切酶HaeIII(賽百盛公司)進(jìn)行酶切,其反應(yīng)體系:3μL限制性內(nèi)切酶,3μL緩沖液,純化PCR產(chǎn)物15μL。TRFLP圖譜采用Genescan軟件進(jìn)行分析。1.4物種豐度和均勻度描述生態(tài)群落種數(shù)的多寡和個(gè)體分布情況常分別采用物種多樣性與均勻度指數(shù)來(lái)表示。本文中以限制性酶切片段(作為一個(gè)OTU)為單位進(jìn)行微群落多樣性指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析,主要包括物種豐度(S)、Shannon-Weiner指數(shù)(H′)和均勻度(E)。物種豐度(richness):S=圖譜中顯著峰的總數(shù)。根據(jù)文獻(xiàn)[32-33]計(jì)算Shannon-Weiner指數(shù):式中Pi表示某個(gè)峰的峰高占總峰高的比例;式中Ni指某個(gè)峰的峰面積,N指總峰面積;均勻度:。此外,使用PRIMER5.0軟件計(jì)算BraylnSCurtis相似性指數(shù),以評(píng)估微生物群落變化前后的相似性。在本文中,如果某細(xì)菌(或古細(xì)菌)的特征TRFLP片段的相對(duì)豐度占5%或以上,則認(rèn)為該細(xì)菌(或古細(xì)菌)為優(yōu)勢(shì)種。2試驗(yàn)結(jié)果與討論2.1模擬裝置的降解一些資料表明,在土壤、河流和海洋沉積物、地下水含水層沉積物中的一些微生物,可以使多環(huán)芳烴在硝酸鹽還原、硫酸鹽還原、鐵和錳還原及產(chǎn)甲烷的厭氧條件下轉(zhuǎn)化,相對(duì)于好氧降解來(lái)說(shuō),PAHs的厭氧降解進(jìn)程較慢,其降解途徑目前還不十分清楚,特別是對(duì)三環(huán)或三環(huán)以上PAHs的厭氧降解機(jī)理還存在著爭(zhēng)議。由圖1可以看出,在反應(yīng)時(shí)間為27天時(shí),菲在甲烷條件下就有明顯的降解;在116天時(shí)模擬裝置中殘余的菲僅15%~23%。其主要原因可能是:受垃圾滲濾液污染的沉積物中經(jīng)長(zhǎng)期馴化,已經(jīng)含有大量能夠降解菲的微生物;在厭氧培養(yǎng)基中含有充足的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素,適合于厭氧微生物的生長(zhǎng)。Alexander和Muckian等認(rèn)為,預(yù)先受多環(huán)芳烴污染的土壤或沉積物樣品能減少多環(huán)芳烴降解所需要的馴化時(shí)間,并增加多環(huán)芳烴降解的速率和程度。2.2細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化圖2反映了沉積物中菲降解細(xì)菌群落在生物降解反應(yīng)前后的變化。由圖2可知,反應(yīng)前(初始樣品細(xì)菌群落中優(yōu)勢(shì)種為70,72,79,80,81,82bp,其中80和81bp的相對(duì)豐度分別為20.8%和22.6%;而反應(yīng)后(第116天)細(xì)菌群落中優(yōu)勢(shì)種為71,80,81,218401bp,因此生物降解反應(yīng)前后優(yōu)勢(shì)菌種類也發(fā)生了變化,特別是新的細(xì)菌種類218和401bp得到顯著的富集增長(zhǎng)。此外,反應(yīng)過(guò)程中許多新的細(xì)菌種類得到了富集,而也有一些細(xì)菌種類消失。由表1還可以得知,反應(yīng)后沉積物樣品中細(xì)菌的物種豐度得到了明顯增加,表征微生物多樣性的Shannon-Weiner指數(shù)(H′)也明顯增加,均勻度也有所增加。然而,反應(yīng)前后細(xì)菌群落的相似性較低(52.07%的相似度),說(shuō)明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化。Gennaro等和Vin?s等的研究結(jié)果也表明,在好氧條件下多壞芳烴在生物降解過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生很大的變化。Piskonen等發(fā)現(xiàn),多環(huán)芳烴蒽在好氧降解過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生重大選擇性演化。在多環(huán)芳烴的好氧生物降解過(guò)程中,多環(huán)芳烴的降解菌的富集已經(jīng)是一個(gè)普遍現(xiàn)象。因此本研究中菲的厭氧降解過(guò)程中一些富集的細(xì)菌也可能與降解菌有關(guān)。圖3反映了沉積物中古細(xì)菌群落在菲生物降解反應(yīng)前后的變化。由圖3可知,反應(yīng)前(初始樣品)古細(xì)菌群落中優(yōu)勢(shì)種為125,306,368,555bp;而反應(yīng)后(第116天)古細(xì)菌群落中優(yōu)勢(shì)種為120,125,306368和555bp。可以看出,生物降解反應(yīng)前后優(yōu)勢(shì)菌種類變化不大。而且反應(yīng)過(guò)程中古細(xì)菌物種變化也不大,幾乎沒(méi)有新的物種增加或消失。由表2可知,Shannon-Weiner指數(shù)(H′)和均勻度都只有輕微的增加,而反應(yīng)前后古細(xì)菌群落的相似性較高(86.57%的