釀酒酵母inwsc1生長曲線的測定及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

釀酒酵母inwsc1生長曲線的測定及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

耿合酶是一些種子植物（如葡萄、花生和松樹）合成白爾醇和其他枸杞代謝的重要酶。大量動物試驗表明,白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗突變、雌激素樣作用以及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等多種生物活性功能。Howitz等認(rèn)為,白藜蘆醇能降低釀酒酵母SIRT1蛋白的米氏常數(shù),提高DNA穩(wěn)定性,使酵母壽命延長70%。這為選擇釀酒酵母作為宿主菌研究芪合酶基因的表達(dá),探索通過酵母菌發(fā)酵來生產(chǎn)含有白藜蘆醇的酵母微生態(tài)制劑提供了理論依據(jù)。該研究在構(gòu)建葡萄芪合酶基因釀酒酵母表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,測定了其生長曲線,掌握菌體生長規(guī)律,從而準(zhǔn)確選定特定生長階段的菌體,以便于重組DNA高效轉(zhuǎn)化釀酒酵母。除了工程菌本身因素外,表達(dá)載體也影響基因表達(dá)產(chǎn)物的成本和實用價值,因此有必要進(jìn)一步檢測重組表達(dá)載體在釀酒酵母中的穩(wěn)定性。1材料和方法1.1材料表面1.1.1生物技術(shù)實驗室釀酒酵母菌株INVSc1由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)實驗室保存;葡萄芪合酶基因釀酒酵母重組質(zhì)粒pYES6/CT-STS由該課題組克隆構(gòu)建。1.1.2母提取物及葡萄糖YPD完全培養(yǎng)基:2%胰蛋白胨,1%酵母提取物,2%葡萄糖;選擇培養(yǎng)基:在YPD完全培養(yǎng)基中加入25μg/mlBlasticidin(殺稻瘟素,Bsd)。1.1.3材料和試劑Bsd為Invitrogen公司產(chǎn)品;鮭魚精DNA(SalmonSpermDNA,ssDNA)購自Sigma;PEG4000購自Merch公司;醋酸鋰為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品;其他試劑均為分析純。試驗設(shè)備有HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺、7200型紫外可見分光光度計等。1.2方法1.2.1我正在接受培訓(xùn)將深凍菌種在冰浴中溶解,然后用無菌接種環(huán)在YPD固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng),30℃于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d,使菌種復(fù)壯。1.2.2ypd菌液比色測定挑取單個菌落接種于50mlYPD液體培養(yǎng)基中,30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)24h,取擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液按照1∶100的接種量接種于3瓶50mlYPD培養(yǎng)基中,同樣條件下振蕩培養(yǎng),并分別于培養(yǎng)后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30h取菌體培養(yǎng)懸液5ml,以未接種的酵母YPD液體培養(yǎng)基校正7200型紫外可見分光光度計的零點,在波長600nm處比色測定菌液的OD600值。以各時間點菌液的吸光光度值(OD600)為縱坐標(biāo),以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),繪制出酵母工程菌的生長曲線。1.2.3高效酵母轉(zhuǎn)化法根據(jù)釀酒酵母生長曲線,在其對數(shù)生長中期制備釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞。采用LiAc/ssDNA/PEG高效酵母轉(zhuǎn)化法,將pYES6/CT-STS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母INVSc1中。用含Bsd的YPD選擇培養(yǎng)基進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的抗性篩選,采用菌落直接PCR法鑒定陽性重組子。1.2.4培養(yǎng)液的制備接種轉(zhuǎn)芪合酶基因釀酒酵母重組菌到20mlYPD培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)24h,將培養(yǎng)液用無菌水稀釋16000倍。取100μl稀釋液涂布在YPD固體平板上,待平板上有菌落形成,用牙簽挑取100個單克隆到固體YPD+Bsd選擇培養(yǎng)基上,菌斑出現(xiàn)后統(tǒng)計YPD+Bsd平板上的菌斑數(shù)量,計算工程菌種質(zhì)粒的丟失率,重復(fù)操作3次。2結(jié)果與分析2.1葡萄酒和發(fā)酵酶的生長曲線由圖1可知,在前6h酵母生長處于延滯期,在6～14h酵母生長處于對數(shù)生長期,14h后菌體生長趨于穩(wěn)定。2.2菌落pcr鑒定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母后,經(jīng)選擇培養(yǎng)基篩選出陽性轉(zhuǎn)化子,進(jìn)行菌落PCR鑒定。由圖2可知,菌落PCR泳道上有清晰約1.2kb的目標(biāo)條帶。這進(jìn)一步說明,經(jīng)Bsd抗性篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子確實攜帶目的片段,pYES6/CT-STS重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入酵母菌。2.3宿主菌株的培養(yǎng)按照“1.2.4”方法檢測芪合酶基因重組質(zhì)粒在釀酒酵母中的穩(wěn)定性。在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中,酵母約90min增殖1代,所以72h約傳了48世代。由表1可知,在YPD+Bsd篩選培養(yǎng)基上,菌落數(shù)均為100,說明該質(zhì)粒在宿主菌中的穩(wěn)定性較高。在0～72h發(fā)酵過程中,質(zhì)粒一直沒有丟失,質(zhì)粒在宿主菌中的穩(wěn)定性達(dá)到100%。3釀酒酵母發(fā)酵試驗秦玉靜等研究指出,不同生長時期的酵母細(xì)胞對轉(zhuǎn)化率影響較大。處于對數(shù)生長中期的酵母細(xì)胞生長旺盛,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定期細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松,因此處于對數(shù)生長中期的酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效果明顯高于穩(wěn)定期的細(xì)胞。不同的菌種有其各自的生長規(guī)律。該試驗通過測定釀酒酵母INVSc1的生長曲線,確定菌體處于對數(shù)生長中期的時間及OD600值,并以此為基準(zhǔn)點制備釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞,明確酵母生長階段是成功制備釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的關(guān)鍵。此外,采用LiAc/ssDNA/PEG高效酵母轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母菌,可以得到較高的轉(zhuǎn)化效率,可以完全滿足將質(zhì)粒DNA引入一個特定酵母菌株的試驗要求。微生物的生長過程大致可分為遲滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期4個時期。該試驗采用分光光度計比濁法測定的酵母菌生長曲線可以明顯反映出菌體生長前3期的變化規(guī)律,沒有出現(xiàn)衰亡期。該結(jié)果與顧淑萍等研究結(jié)果一致。顧淑萍等認(rèn)為,在測定微生物生長曲線時,以活菌計數(shù)法較準(zhǔn)確。但就該試驗而言,為了確定酵母菌處于對數(shù)生長中期的時間及OD600值,采用比濁法較之活菌計數(shù)法操