五種瘤胃微生物基因組dna提取方法比較

五種瘤胃微生物基因組dna提取方法比較

腫瘤微生態(tài)是一種復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，由大量的古細(xì)菌、真菌、真菌和原生動(dòng)物組成。這一系統(tǒng)是世界上纖維原生動(dòng)物轉(zhuǎn)化使用最有效的自然系統(tǒng)之一。瘤胃微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)能夠?yàn)樗拗鲃?dòng)物提供能量,蛋白質(zhì),氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),是研究反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝的關(guān)鍵。但是由于瘤胃微生物數(shù)量巨大,種類繁多,且絕大多數(shù)是嚴(yán)格厭氧或兼性厭氧,體外培養(yǎng)困難,再加上大量不可培養(yǎng)微生物的存在,采用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)很難對(duì)瘤胃微生物進(jìn)行更加全面而深入的認(rèn)識(shí)。近年來,隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展,為瘤胃微生物的研究提供了新的技術(shù)和手段,特別是微生物rDNA分子生物技術(shù)為瘤胃微生物的評(píng)價(jià)開辟了新的途徑。能提取出環(huán)境微生物中的總DNA就可以對(duì)復(fù)雜的微生物系統(tǒng)進(jìn)行大量系統(tǒng)的研究,還可以用于檢測(cè)不可培養(yǎng)的微生物,跟蹤某些目標(biāo)菌株在自然環(huán)境中的行為,也可用來揭示微環(huán)境中基因多樣性及其隨環(huán)境變化的特征。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)環(huán)境微生物樣品如土壤,海洋,淤泥,垃圾等進(jìn)行rDNA序列和分析序列系統(tǒng)發(fā)展及多樣性研究已有大量報(bào)道,其中不乏有關(guān)通過免培養(yǎng)技術(shù)對(duì)瘤胃微生態(tài)的研究報(bào)道,如ChristopherMcSweeney,RoderickMackie,王遠(yuǎn)亮等,提出了多種提取瘤胃微生物DNA的方法,但是將這些方法進(jìn)行系統(tǒng)比較的研究較少,而獲得有代表性的瘤胃微生物DNA將有助于研究瘤胃中微生物區(qū)系隨環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化及其多樣性,本試驗(yàn)以此為出發(fā)點(diǎn)摸索瘤胃微生物基因組DNA的提取方法,為后續(xù)分子生物學(xué)研究提供質(zhì)量和純度較高的樣本DNA。1材料和方法1.1材料表面瘤胃內(nèi)容物來自于安裝有永久性瘤胃瘺管的蒙古綿羊。1.2樣品的預(yù)處理參見文獻(xiàn)中樣品處理方法。1.3提取的dna1.3.1菌體沉淀液的制備取100μL1.3中處理過的樣品,用9倍體積生理鹽水洗滌2次,獲得菌體沉淀。以下各方法所用菌液均來自于同一樣本,取樣量均為100μL。1.3.2提取各組dna選取國(guó)內(nèi)外常用的五種提取微生物基因組DNA方法,分別提取1.3.1中收集的菌體沉淀中微生物DNA。(1)水煮法參照文獻(xiàn)中DNA提取方法,略做改進(jìn),加入溶菌酶37℃消化1h。(2)溶解酶sds-苯酚或氯仿法參照文獻(xiàn)中DNA提取方法。(3)經(jīng)典苯酚法參照文獻(xiàn)中DNA提取方法。(4)氯化氯仿法照文獻(xiàn)中DNA提取方法。(5)飽和酚/氯-異戊醇的制備參照文獻(xiàn)中DNA提取方法,經(jīng)修改后具體步驟如下:菌體沉淀中加500μL分離緩沖液(100mmol/LTris-HClpH8.0,50mmol/LEDTA,0.1%SDS,200μg/mL蛋白酶K),使菌體充分懸浮,加入0.5g玻璃微珠(TIANGEN公司,200-400目),漩渦振蕩器上震蕩3min,再加入10μLβ-巰基已醇,1%(g/V)PVP(聚乙烯基吡咯烷酮),50℃消化1h,期間不斷混勻;加入65μL10%(g/V)CTAB(十六烷基三甲基溴化銨),120μLNaCl,混勻,55~65℃水浴3h或過夜消化;用等體積的飽和酚/氯仿/異戊醇,氯仿/異戊醇各抽提1次,取上清液加入等體積的異丙醇和1/10體積的3mol/LNaAC,冰上放置15min,12000r/min,4℃,離心10min;70%乙醇洗滌2次,晾干,加入100μL1×TE,加入適量Rnase,37℃處理30min,4℃?zhèn)溆谩?.4含量、純度和電泳試驗(yàn)用紫外可見分光光度計(jì)(Eppendorf)測(cè)定各DNA濃度和純度,0.8%瓊脂糖凝膠電泳DNA,拍照觀察。1.5粗提dna的純化采用TIANGEN公司的DNA產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)1.3中5種方法粗提的DNA進(jìn)行純化,DNA純化后溶于分別100μL無菌ddH2O,供DNA含量和純度的測(cè)定以及作PCR擴(kuò)增的模板。1.6對(duì)dna質(zhì)量的檢測(cè)1.6.1pcr檢測(cè)驅(qū)動(dòng)下的3dna片段通過1.4中對(duì)各方法提取的DNA含量、純度和電泳檢測(cè)結(jié)果,選取其中較優(yōu)的方法,以此方法提取的DNA為模板,純化后擴(kuò)增瘤胃古細(xì)菌,真細(xì)菌和真菌16/18SrDNA片斷,以檢測(cè)DNA的質(zhì)量和完整性。各個(gè)體系設(shè)3個(gè)重復(fù),所用引物序列見表1。其中真細(xì)菌的引物為FP27,EUB338。PCR反應(yīng)體系(20μL):2×premixExTaq預(yù)混液10μL,10μmol/L的引物各0.8μL,模板(瘤胃微生物總DNA)5μL,ddH2O3.4μL。PCR反應(yīng)參數(shù):94℃變性4min;95℃40s,51~61℃1min,72℃1.5min;共35個(gè)循環(huán);72℃7min。1.6.2srdna片段的pcr擴(kuò)增纖維降解菌為瘤胃降解粗纖維的主要功能菌,以1.4中篩選出的較優(yōu)方法提取的DNA為模板,擴(kuò)增3種主要的纖維降解菌Fibrobactersuccinogenes、Ruminococcusflavefaciens、Ruminococcusalbus的16SrDNA片斷,以進(jìn)一步檢測(cè)該DNA的全面性。各個(gè)體系設(shè)3個(gè)重復(fù),PCR反應(yīng)體系、和參數(shù)同1.6.1,擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)觀察,拍照。所用引物序列見表2。2結(jié)果與分析2.1種方法所提取dna的純度和純度反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)容物成分復(fù)雜,含有龐大的微生物種群,以及飼料殘?jiān)?動(dòng)物消化道脫落細(xì)胞和許多不明生物物質(zhì),使粗提得到的DNA含有非常多的雜質(zhì)。由于瘤胃液中色素、酚與多糖含量高,本身呈黃色,粗提的DNA也略帶黃色。圖1為5種方法粗提DNA電泳結(jié)果,其中溶菌酶-水煮法條帶不清楚,且亮度不夠,說明這種方法很難裂解復(fù)雜的瘤胃微生物細(xì)胞,不適合用來提取瘤胃微生物總DNA。而溶菌酶-SDS-酚/氯仿法、經(jīng)典酚/氯仿法、氯化芐法和珠磨-SDS/CTAB/PVP法均有條帶出現(xiàn),片段長(zhǎng)度在20kb以上,但電泳膠孔中含有多糖和大分子不明物質(zhì),并且有拖尾現(xiàn)象。表3所示為用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定各DNA濃度和純度,進(jìn)一步檢測(cè)1.4中5種方法粗提DNA的含量與純度。由表中結(jié)果可以看出5種方法所提取的瘤胃微生物DNA純度和含量均有顯著差異,其中改進(jìn)后得珠磨-SDS/CTAB法提取DNA的純度和含量均居5種方法之首。圖2是將圖1中出現(xiàn)條帶的粗提DNA進(jìn)行純化的結(jié)果,可見溶菌酶-SDS-酚/氯仿法粗提的DNA經(jīng)純化后條代亮度明顯降低,而珠磨-SDS/CTAB/PVP法,氯化芐法,經(jīng)典酚/氯仿法各個(gè)泳道的DNA條帶集中、清晰,膠孔都很干凈。經(jīng)過純化后的DNA沉淀顏色較白,說明色素等有色雜質(zhì)被去除。用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)得OD260/OD280達(dá)到1.8以上。較純化前條帶亮度均略有下降,原因可能是粗提DNA中含有許多DNA小片段或殘留RNA片斷,在純化過程中被除去;另外純化試劑盒回收效率無法達(dá)到100%(試劑盒中說明回收效率在80%以上)。綜合以上5種方法,珠磨-SDS/CTAB/PVP法提取得到的DNA樣本純度以及得率都居5種方法之首,優(yōu)于其他4種方法,所以本試驗(yàn)初步確定珠磨-SDS/CTAB/PVP法為提取綿羊瘤胃微生物基因組DNA最優(yōu)方法,為了證明這種方法的適用性,又對(duì)此DNA質(zhì)量進(jìn)行了分子生物學(xué)手段檢測(cè)。2.2菌株鑒定及pcr擴(kuò)增結(jié)果圖3為以珠磨-SDS/CTAB/PVP法提取的DNA為模板,擴(kuò)增綿羊瘤胃古細(xì)菌,真細(xì)菌和真菌16/18SrDNA片斷。由圖可見以珠磨-SDS/CTAB/PVP法提取獲得的DNA為模板分別擴(kuò)增瘤胃古細(xì)菌、真細(xì)菌和真菌都能獲得較理想的結(jié)果,真細(xì)菌預(yù)計(jì)所擴(kuò)增片段為331bp,其PCR擴(kuò)增結(jié)果在300~400bp之間出現(xiàn)條帶;古細(xì)菌預(yù)計(jì)所擴(kuò)增片段為910bp,其PCR擴(kuò)增結(jié)果在900~1000bp之間出現(xiàn)條帶;真菌預(yù)計(jì)所擴(kuò)增片段為785bp,其PCR擴(kuò)增結(jié)果在700~800bp之間出現(xiàn)條帶。以上3種菌的擴(kuò)增結(jié)果都與原目標(biāo)片段相符,且擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定,重現(xiàn)性較好。圖4為珠磨-SDS/CTAB/PVP法提取的DNA為模板,擴(kuò)增瘤胃3種纖維降解菌的16SrDNA,Fibrobactersuccinogenes預(yù)計(jì)所擴(kuò)增片段為446bp,其PCR擴(kuò)增結(jié)果在400~500bp之間出現(xiàn)條帶;Ruminococcusflavefaciens預(yù)計(jì)所擴(kuò)增片段為173bp,其PCR擴(kuò)增結(jié)果在100~200bp之間出現(xiàn)條帶;Ruminococcusalbus預(yù)計(jì)所擴(kuò)增片段為178bp,其PCR擴(kuò)增結(jié)果在100~200bp之間出現(xiàn)條帶以上3種菌的擴(kuò)增結(jié)果都與原目標(biāo)片段相符,且擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定,重現(xiàn)性較好。以上分子生物學(xué)手段檢測(cè)結(jié)果說明利用珠磨-SDS/CTAB/PVP法可以得到瘤胃微生態(tài)中絕大部分微生物的基因組DNA。粗DNA純化后,可以滿足PCR分子生物學(xué)操作的要求。3pcr擴(kuò)增的效果分析由于瘤胃內(nèi)環(huán)境及其中微生物的復(fù)雜性,目前還缺少選擇性培養(yǎng)基,常規(guī)傳統(tǒng)分析微生物的方法受到了極大的限制。鑒于此原因國(guó)內(nèi)外研究者都紛紛避開了傳統(tǒng)培養(yǎng)而直接從瘤胃內(nèi)容物中提取微生物DNA,利用免培養(yǎng)技術(shù)研究瘤胃微生態(tài),如王遠(yuǎn)亮采用未培養(yǎng)技術(shù)對(duì)荷斯坦奶牛瘤胃細(xì)菌多樣性進(jìn)行初步研究;TajimaK通過16SrDNA序列分析瘤胃細(xì)菌區(qū)系等。本研究選取了5個(gè)實(shí)驗(yàn)室常用提取微生物DNA的方法進(jìn)行了比較,并對(duì)其中有的方法做了一定改進(jìn),得出珠磨-SDS/CTAB/PVP法所提取得到的DNA在純度和濃度上都優(yōu)于其它幾種方法,粗提DNA產(chǎn)量達(dá)(851.78±9.86)μg/mL,OD260/OD280在1.7左右;PCR擴(kuò)增古細(xì)菌、真細(xì)菌和真菌16/18SrDNA片斷均得到了預(yù)期的效果,擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定,重現(xiàn)性較好;限制性內(nèi)切酶分析也得到了較為理想的效果。分析其原因可能在于對(duì)細(xì)胞裂解的差異,在提取DNA過程中,細(xì)胞裂解是非常重要的環(huán)節(jié),因細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含成分不同,樣品細(xì)胞裂解也有所不同。SDS法一般適用于血液,細(xì)胞,動(dòng)物組織,細(xì)菌,酵母等;CTAB法和氯化芐適用于植物組織,真菌等;此外還有物理方式,化學(xué)方式和酶法,主要針對(duì)一些細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜,難于裂解的樣品。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)容物微生物種群含有大量革蘭氏陰性菌,革蘭氏陽(yáng)性菌,真菌及其游動(dòng)孢子等微生物,使得細(xì)胞破壁顯得更加關(guān)鍵。本研究得出采用珠磨-SDS/CTAB法提取獲得的瘤胃微生物總DNA結(jié)果較好,該方法鑒于有些瘤胃微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊且較難裂解,以玻璃珠機(jī)械破壁為主,使用CTAB與SDS相結(jié)合來裂解消化細(xì)胞,兼顧大多數(shù)瘤胃微生物特性,混合DNA中包含了各種古細(xì)菌、真細(xì)菌和真菌的基因組DNA。另外裂解過程中加入了β-巰基乙醇和PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)來排除酚等次生干擾物質(zhì),緩解褐色沉淀。一般而言來自環(huán)境中的樣品含有非常復(fù)雜的成分,瘤胃微生物樣品中也存在同樣問題。粗提DNA中大量雜質(zhì)直接影響后續(xù)的分子生物學(xué)操作,如PCR,核酸雜交,內(nèi)切酶消化等,所以瘤胃微生物中提取的DNA樣品也需要進(jìn)行純化。本