蛋白質的性質實驗

蛋白質的性質實驗

【目的和要求】1.學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方法及其原理。2.了解蛋白質的兩性解離性質。初步學會測定蛋白質等電點的方法。3.加深對蛋白質膠體分子穩(wěn)定因素的認識，了解蛋白質的沉淀反應、變性作用的原理及其相互關系?！緦嶒炘怼浚ㄒ唬┑鞍踪|及氨基酸的呈色反應蛋白…【目的和要求】

1.學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方法及其原理。

2.了解蛋白質的兩性解離性質。初步學會測定蛋白質等電點的方法。

3.加深對蛋白質膠體分子穩(wěn)定因素的認識，了解蛋白質的沉淀反應、變性作用的原理及其相互關系。

【實驗原理】

（一）蛋白質及氨基酸的呈色反應

蛋白質所含有的某些氨基酸具有特殊結構，可以與某些試劑反應，生成有色物質。

1.雙縮脲反應

尿素被加熱至180℃左右時，兩分子尿素縮合放出一分子氨而形成雙縮脲。雙縮脲在堿性條件下可與Cu2+結合生成復雜的紫紅色化合物。此反應稱為雙縮脲反應。所有含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物均有此反應。

蛋白質或二肽以上的多肽分子中，含有多個與雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也有雙縮脲反應，可用此法鑒定蛋白質的存在或測定其含量。

2.茚三酮反應

蛋白質、多肽和各種氨基酸具有茚三酮反應。除無α-氨基的脯氨酸和羥脯氨酸呈黃色外，其他氨基酸生成紫紅色，最終為藍色化合物。

除蛋白質、多肽和各種氨基酸能進行茚三酮反應外，氨、β-丙氨酸和許多一級胺化合物都有此反應。該反應靈敏度達1：1500000（pH5-7）。現(xiàn)已廣泛地用于氨基酸定量測定。

3.黃色反應

凡是含有苯基的化合物都可與濃硝酸反應產(chǎn)生黃色化合物。芳香族氨基酸及含有酪氨酸和色氨酸的蛋白質分子具有此反應。苯丙氨酸很難反應，需加少量濃硫酸才有黃色反應。

(二)蛋白質的兩性反應及等電點的測定

蛋白質和氨基酸一樣是兩性電解質。調節(jié)溶液的酸堿度達到一定的離子濃度時，蛋白質分子所帶的正電荷和負電荷相等，以兼性離子狀態(tài)存在，在電場內(nèi)該蛋白質分子既不向陰極移動，也不向陽極移動，這時溶液的pH值稱為該蛋白質的等電點(pI)。當溶液的pH值低于蛋白質等電點時，即在H+較多的條件下，蛋白質分子帶正電荷成為陽離子，當溶液的pH值大于等電點時，即在OH—較多的條件下，蛋白質分子帶負電荷成為陰離子。

本實驗采用蛋白質在不同pH溶液中形成的混濁度來確定其等電點，在等電點時蛋白質溶解度最小，最容易沉淀析出。食品檢驗—氨基酸總量測定蛋白質經(jīng)水解或酶解可由大分子變成小的pro成分，如水解后的產(chǎn)物經(jīng)胨，肽等最后成為氨基酸，氨基酸是構成pro最基本的物質。水解后的pro和水解前的pro在物理特性，化學結構以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差別與水解的程度有密切關系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以評價食品的營養(yǎng)價值。氨基酸不是單純的一種物質，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸（儀器價格昂貴，不能普遍使用），對于食品來說有時有很多種氨基酸可以同時存在于一種食品中，所以需要測定總的氨基酸量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸態(tài)氮）的百分率表示，當然，如果食品中只含有一種氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以從含氮量計算出氨基酸的含量。食品在評價蛋白質的營養(yǎng)價值時，除了測定pro的含量，氨基酸氮含量，還需要對各種氨基酸進行分離，鑒定，尤其對8種人體必需氨基酸進行定量定性分析。一．單指示劑甲醛滴定法：1原理：氨基酸具有酸，堿兩重性質，因為氨基酸含有-COOH基，而-COOH基顯示酸性，又含有-NH2，-NH2則顯示堿性，由于-COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽，當加入甲醛溶液時，-NH2與甲醛結合，其堿性消失，破壞內(nèi)鹽的存在，就可用堿來滴定-COOH基，以間接方法測定氨基酸的量，反應式以三種形式存在。用堿完全中和-COOH基時的PH值為8.4~9.2。2試劑：（1）40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，將甲醛用1NNaOH溶液中和（淡蘭色）。（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。（3）0.100NNaOH標準溶液。3操作步驟：稱約含20mg左右的氨基酸→于燒杯中（如為固體樣加水50ml）→加兩滴指示劑→用0.1NNaOH溶液滴定到淡蘭色→加中性甲醛20ml→搖勻→靜置1分鐘→此時蘭色應消失→再用0.1NNaOH溶液滴定淡蘭色，記錄兩次滴定所消耗的堿液毫升數(shù)。計算：氨基酸態(tài)氮=（N×V×0.014×100）/W×100二．雙指示劑甲醛滴定法1原理：與單色法相同，只是在此法中使用了兩種指示劑，從分析結果看，雙指示劑甲醛滴定法與亞硝酸氮氣容量法（此法操作復雜，但準確，不作介紹）相近，單色滴定法稍偏低，主要因為單指示劑甲醛滴定法是以氨基酸溶液的PH值作為中性紅的終點，PH值為7.0，從理論計算看，雙色滴定法比單色滴定法準確。2試劑：同單指示劑一樣，多一個0.1%中性紅（50%乙醇溶液）3操作步驟：取相同兩份樣品→分別于100ml三角瓶→一份加中性紅2滴→用0.1NNaOH滴定終點（由紅變琥珀色），記錄用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→搖勻→用0.1NNaOH滴至淡蘭色。計算：氨基酸態(tài)氮=（N×（V2-V1）×0.014×100）/W×100V1——用中性紅為指示劑時，堿液所消耗的體積V2——用百里酚酞乙醇液為指示劑時標液消耗量0.014——氮的毫克當量濃度注意事項：（1）單色指示劑甲醛滴定法，用堿完全中和—COOH基時的pH為8.5—9.5（2）測定樣品的顏色較深，應加活性炭脫色之后再滴定三．茚三酮比色法：1原理：氨基酸在一定pH范圍內(nèi)，能與茚三酮生成蘭紫色化合物?？梢杂帽壬ǘ繙y定。2試劑：（1）磷酸緩沖液（pH.8.04）制備方法如下：稱磷酸二氫鉀4.5350g。定容500ml稱NAH2PO4·12H2O11.9380g分別溶解定容500ml取磷酸二氫鉀10ml與磷酸氫二鈉190ml混合即為pH8.04的緩沖液（2）2%茚三酮溶液：稱茚三酮1g→溶于35ml熱水→加入40mg氯化亞錫（SnCl2·H2O）攪拌過濾（作防腐劑）→于冷暗處過夜→定容50ml①氨基酸標液稱干燥氨基酸（如異亮氨酸）0.2000g→溶解定容100ml→搖勻→吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml，即得200Ug/ml標液3操作方法：（1）繪制標準曲線：取7個25ml容量瓶，吸取標液00.51.01.52.02.53.0ml于7個25ml容量瓶，加水補充至容積為4ml，然后加茚三酮和緩沖液各1ml，于水浴加熱15分鐘，冷卻后定容25ml，靜置15分鐘，在570nm下測消光值，繪制標準曲線。（2）樣品測定：取樣品5.00~10.0g（液體樣5-10ml）→于燒杯中→加50ml水和活性碳約5g→加熱過濾→用30—40ml熱水洗滌活性炭→吸澄清樣液1~4ml→加茚三酮和緩沖液各1ml水浴加熱15分鐘，冷卻定容，靜置15分鐘于570nm下測定消光值，按下式計算氨基酸含量。氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W×1000）×100C——從標準曲線上查得得氨基酸的量（Ug）W——測定得樣品溶液相當于樣品的量（g）注意事項：茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進行純化，方法如下：、取10g茚三酮容于40ml熱水中，加一克活性炭，搖勻靜置30分鐘，過濾，將濾液放入冰箱中過濾，即出現(xiàn)蘭色結晶，過濾，用2ml冷水洗滌結晶，置干燥皿中干燥，裝瓶備用。思考題：1試述蛋白質測定中，樣品消化過程所必須注意的