第九章免疫學(xué)方法及其應(yīng)用(修改)

第九章傳染與免疫第一節(jié)傳染自學(xué)第二節(jié)非特異性免疫第三節(jié)特異性免疫自學(xué)！病原微生物感染機(jī)體對(duì)抗免疫免疫學(xué)幾個(gè)基本概念免疫(immunity)：是人和動(dòng)物機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng)，其作用是“識(shí)別”和排除抗原性“異物”，以維持機(jī)體生理的平衡和穩(wěn)定。免疫學(xué)：研究機(jī)體自我識(shí)別和對(duì)抗原性異物排斥反應(yīng)的一門(mén)科學(xué)。傳統(tǒng)的免疫概念：機(jī)體抵抗病原微生物的能力，即抗傳染免疫1.免疫和免疫學(xué)2.免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)：具有自身的運(yùn)行機(jī)制并可與其他系統(tǒng)相互配合、相互制約，共同維持機(jī)體在生命過(guò)程中總的生理平衡。免疫系統(tǒng)的任務(wù)是消滅“異己”“異己”來(lái)自?xún)蓚€(gè)方面:外來(lái)的入侵者：侵入身體的各種致病菌包括哪些？(2)“變壞了的”自身細(xì)胞。細(xì)胞癌變免疫系統(tǒng)的生理功能①免疫防御——機(jī)體排斥外源性抗原異物的能力。②免疫自穩(wěn)——機(jī)體識(shí)別和清除自身衰老殘損的組織、細(xì)胞，維持正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。③免疫監(jiān)視——機(jī)體殺傷和清除異常突變細(xì)胞，機(jī)體監(jiān)視和抑制惡性腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)。(1)探針帶來(lái)細(xì)菌入侵(2)吞噬細(xì)胞趕赴“現(xiàn)場(chǎng)”(3)消滅入侵恢復(fù)健康

機(jī)體防御機(jī)制人體第一道防線(xiàn)———天然免疫(非特異性免疫)屏障結(jié)構(gòu)、非特異性免疫細(xì)胞和免疫分子組成。人體第二道防線(xiàn)———獲得性免疫(特異性免疫)分類(lèi)：體液免疫細(xì)胞免疫

抗感染免疫的構(gòu)成因素天然免疫與獲得性免疫的關(guān)系◆在抗感染免疫過(guò)程中，天然免疫與獲得性免疫相互依賴(lài)與協(xié)作，共同發(fā)揮消除病原微生物感染的作用。吞噬細(xì)胞的吞噬和殺菌過(guò)程示意圖第三節(jié)特異性免疫包括兩個(gè)基本內(nèi)容：（1）免疫原性：抗原刺激有機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的能力；（2）反應(yīng)原性：抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的能力；抗原性：免疫原性和反應(yīng)原性的統(tǒng)稱(chēng)。

三免疫分子及其在體液免疫中的作用㈠、抗原與抗體簡(jiǎn)介抗原(antigen)

定義：凡是能刺激有機(jī)體(人或動(dòng)物體)產(chǎn)生抗體，并能與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。(一)、抗原1、抗原的基本性質(zhì)（1）異物性（2）大分子量（3）特異性

抗原刺激機(jī)體后只能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體并能與之結(jié)合。

特異性是由抗原表面的抗原決定基(簇)決定的。

抗原決定基（表位）：抗原分子中決定抗原特異性的基本結(jié)構(gòu)或具有化學(xué)活性的基團(tuán)。抗原決定基是與抗體特異性結(jié)合的基本單位。（4）化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜

免疫原性的形成還要求蛋白質(zhì)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜。極性基團(tuán)愈多或含支鏈氨基酸愈多，以及帶芳香族氨基酸多的蛋白質(zhì)抗原性愈強(qiáng)。

2、抗原的種類(lèi)按抗原性的完整與否及其在機(jī)體內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)，可分為完全抗原和不完全抗原。（1）完全抗原與不完全抗原①完全抗原既有免疫原性又有反應(yīng)原性。即能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并與產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)或體外(試管內(nèi))發(fā)生反應(yīng)的抗原。

如細(xì)菌、病毒、外毒素、血清白蛋白、花粉蛋白、②不完全抗原（半抗原）只有反應(yīng)原性而沒(méi)有免疫原性。即不能單獨(dú)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，若與蛋白質(zhì)或膠體顆粒結(jié)合，形成大分子復(fù)合物成為完全抗原，則可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。

如各種低分子量的藥物、脂類(lèi)和多糖等都屬于不完全抗原。（2）細(xì)菌抗原①菌體抗原（O抗原）在細(xì)胞壁上，主要抗原。主要成分為脂多糖。根據(jù)O抗原的組成不同進(jìn)行分群。O抗原耐熱，121℃，2h不被破壞。如沙門(mén)氏菌屬的O抗原不同分成67個(gè)血清群。

②鞭毛抗原（H抗原）在鞭毛中，由蛋白質(zhì)組成，具有不同的種和型特異性，可作菌型鑒別。H抗原不耐熱，56～80℃，30～40min即被破壞。在制備O抗原時(shí)常用煮沸法消除H抗原。2、抗原的種類(lèi)（2）細(xì)菌抗原③表面抗原（表面抗原）包圍在細(xì)菌細(xì)胞壁最外面，故稱(chēng)。表面抗原隨菌種和結(jié)構(gòu)的不同可有不同的名稱(chēng)。如肺炎鏈球菌——莢膜抗原；大腸桿菌、痢疾志賀氏菌——包膜抗原或K抗原，沙門(mén)氏菌屬——Vi抗原等。④菌毛抗原

存在于菌毛中的抗原，也具有特異的抗原性。⑤外毒素和類(lèi)毒素

細(xì)菌外毒素具有很強(qiáng)的抗原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗毒素抗體。外毒素經(jīng)0.3%～0.4%甲醛溶液處理后使其失去毒性，但仍保持抗原性，即成為類(lèi)毒素。2、抗原的種類(lèi)（2）細(xì)菌抗原(二)、抗體(antibody,Ab)定義：抗原刺激有機(jī)體(人或動(dòng)物)所產(chǎn)生的具有特異性的免疫球蛋白?？贵w是由B細(xì)胞識(shí)別抗原后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的一類(lèi)糖蛋白，能與相應(yīng)抗原表位結(jié)合，是介導(dǎo)體液免疫的重要免疫分子。分泌型(secretedIg,sIg)：膜型(membraneIg,mlg)：在血清和組織液中，占全部機(jī)體血清的20%～25%。具有抗體的各種免疫功能是B細(xì)胞表面的抗原受體。含有免疫球蛋白的血清，稱(chēng)為免疫血清或抗血清。(二)、抗體1、抗體的性質(zhì)（1）免疫球蛋白是一種糖蛋白，具有蛋白質(zhì)的通性。凡能破壞球蛋白的各種理化因素均能使之滅活；能被多種蛋白水解酶裂解；可以在乙醇、三氯醋酸或中性鹽類(lèi)中沉淀，生產(chǎn)上常用50%飽和硫酸銨或硫酸鈉從免疫血清中提取抗體球蛋白。（2）在體外(試管內(nèi))，抗體可與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合并出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)；在體內(nèi)，與其他防御機(jī)能協(xié)同作用下殺滅病原菌，起到抗感染作用。但某些抗體在機(jī)體內(nèi)與相應(yīng)的抗原相遇時(shí)，能引起變態(tài)反應(yīng)。如青霉素過(guò)敏等。（3）由不同細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體具有不均一性和結(jié)構(gòu)的多樣性。

例如將血清電泳時(shí)，免疫球蛋白主要分布于γ球蛋白區(qū)，因而曾稱(chēng)抗體為γ球蛋白，也有少量延伸到β區(qū)和α2區(qū)?？贵w作為一種球蛋白，對(duì)異種動(dòng)物又是很好抗原。因此,抗體即是抗體，又是抗原。利用此種特性可以制備抗免疫球蛋白抗體(或稱(chēng)抗抗體)，用于熒光抗體技術(shù)中(間接法)。1、抗體的性質(zhì)2、抗體的基本結(jié)構(gòu)兩條重鏈(H鏈)兩條輕鏈(H鏈)440個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約50～70kD220個(gè)氨基酸組成，分子量約22.5kD。二硫鍵(-S·S-)根據(jù)重鏈的氨基酸順序同源程度的差異，可將Ig分為類(lèi)和亞類(lèi)。人的免疫球蛋白共5類(lèi)：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE2、抗體的基本結(jié)構(gòu)N端可變區(qū)恒定區(qū)鍵間二硫鍵輕鏈重鏈C端CDR區(qū)識(shí)別抗原構(gòu)架區(qū)2、抗體的基本結(jié)構(gòu)①免疫抗體3、抗體的種類(lèi)

（1）根據(jù)抗體獲得方式分類(lèi)②天然抗體③自身抗體（2）根據(jù)抗體作用對(duì)象分類(lèi)①抗菌性抗體②抗毒性抗體③抗病毒性抗體④過(guò)敏性抗體動(dòng)物患傳染病后或經(jīng)人工注射疫苗后產(chǎn)生動(dòng)物先天就有的抗體，可以遺傳給后代

機(jī)體對(duì)自身組織成分產(chǎn)生的抗體

細(xì)菌或內(nèi)毒素刺激機(jī)體所產(chǎn)生的抗體

細(xì)菌外毒素刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體

病毒刺激機(jī)體而產(chǎn)生的抗體，阻止病毒侵害異種動(dòng)物血清進(jìn)入機(jī)體后所產(chǎn)生的使動(dòng)物發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的抗體

4、人工制備抗體（1）多克隆抗體(polyclonalantibody，PoAb)定義：

將抗原免疫動(dòng)物，刺激動(dòng)物體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體，是針對(duì)多種抗原決定基的混合抗體。特點(diǎn)：來(lái)源廣泛、制備容易，但不易大量制備；特異性不高，常出現(xiàn)交叉反應(yīng)；評(píng)價(jià)：應(yīng)用受到限制。4、人工制備抗體（2）單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)

原理:淋巴細(xì)胞增殖分化的漿細(xì)胞(來(lái)自脾臟，有抗原特異性,能產(chǎn)生抗體，但短壽)

骨髓瘤細(xì)胞(無(wú)抗原特異性，但長(zhǎng)壽，能在體外無(wú)限繁殖)

利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，

獲得既能在體外培養(yǎng)又能產(chǎn)生單一抗體的雜交瘤細(xì)胞。特點(diǎn)：純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、無(wú)或少血清交叉反應(yīng)，制備成本低等特性。已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。

4、人工制備抗體單克隆抗體制備示意圖單克隆抗體制作過(guò)程4、人工制備抗體（2）單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)應(yīng)用：已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。

①對(duì)微生物病原體的鑒定。②特異性抗原或腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的檢測(cè)和鑒定。③疾病的被動(dòng)免疫治療和生物導(dǎo)向藥物的制備。④檢測(cè)血液中的藥物含量。⑤分離某些昂貴的生物活性物質(zhì)。

4、人工制備抗體（3）基因工程抗體（重組抗體）在基因水平上對(duì)Ig分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，重新組裝成的新型抗體分子。。特點(diǎn)：保留天然抗體的特異性和主要生物學(xué)活性，去除或減少了無(wú)關(guān)結(jié)構(gòu)，并可賦予抗體分子以新的生物學(xué)活性。迄今已成功構(gòu)建多種基因工程抗體，如人-鼠嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體(ScFv)、雙特異性抗體(BsAb)及噬菌體抗體等。

一.抗原與抗體反應(yīng)的一般規(guī)律抗原抗體反應(yīng)：抗原與相應(yīng)抗體之間在體內(nèi)或體外所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。體內(nèi)反應(yīng)：介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應(yīng)：根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類(lèi)型及參與反應(yīng)的介質(zhì)不同，可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類(lèi)型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測(cè)中多用血清作試驗(yàn)，故體外抗原抗體反應(yīng)亦稱(chēng)為血清學(xué)反應(yīng)。第四節(jié)免疫學(xué)方法及其應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)的一般特點(diǎn)1.特異性與交叉性

特異性：一種抗原只能與它相應(yīng)的抗體結(jié)合。交叉性：兩種不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗體間構(gòu)型部分相同，就可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2.可逆性

抗體與抗原的結(jié)合是分子表面的一種物理結(jié)合即非共價(jià)鍵的結(jié)合，在一定條件下可以發(fā)生解離。分開(kāi)后，二者的性質(zhì)不變。3.定比性

抗原物質(zhì)是多價(jià)的；抗體是雙價(jià)的?？乖贵w的結(jié)合是抗原—抗體—抗原—抗體這樣順次結(jié)合，只有當(dāng)兩者比例合適時(shí)，聚集成較大的復(fù)合物才能出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的一般特點(diǎn)3.定比性圖7-4沉淀反應(yīng)的曲線(xiàn)每一個(gè)Y字形的Ig單體分子能結(jié)合2個(gè)抗原表位，稱(chēng)之為兩價(jià)；分泌型IgA為4價(jià)；五聚體IgM理論上為10價(jià)，但由于立體構(gòu)型的空間阻位，一般只能結(jié)合5個(gè)抗原表位?？乖贵w反應(yīng)的一般特點(diǎn)4.階段性

第一階段：發(fā)生特異性反應(yīng)，特點(diǎn)是反應(yīng)快，不被肉眼所見(jiàn)。第二階段：可見(jiàn)階段，是非特異性的。反應(yīng)較慢，受到電解質(zhì)、pH值和溫度的影響。5.敏感性

高度的敏感性，用于定性，還可用于定量和定位。影響抗原抗體反應(yīng)的因素1.電解質(zhì)4.雜質(zhì)異物0.85％的NaCl生理鹽水2.溫度37℃水浴3.pH值多數(shù)血清學(xué)反應(yīng)的適宜pH值為6～8二、抗原、抗體間的主要反應(yīng)1、凝集反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)3、免疫電泳4、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)

三、主要抗原抗體反應(yīng)(一)、凝集反應(yīng)

定義：顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體在有電解質(zhì)合適條件下反應(yīng)并出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集團(tuán)現(xiàn)象。（凝集原，凝集素）一般稀釋抗體(抗血清)，使其與抗原有一合適比例。1直接凝集反應(yīng)①玻片法

定性試驗(yàn)。用已知抗體檢測(cè)未知抗原。

用途：鑒定菌種，菌種分型，測(cè)定ABO血型等。

②試管法

定量試驗(yàn)。用已知抗原測(cè)定血清中抗體有無(wú)及相對(duì)含量發(fā)生明顯凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度（抗體效價(jià)，滴度)，以表示血清中抗體的相對(duì)含量。

用途：測(cè)定患傳染病的人或家畜血清中的抗體，診斷三、主要抗原抗體反應(yīng)2.間接凝集反應(yīng)定義：利用某些與免疫無(wú)關(guān)的均一的小顆粒物質(zhì)作為載體，將可溶性抗原(或抗體)吸附于表面，如與相應(yīng)的抗體(或抗原)結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，發(fā)生凝集現(xiàn)象。表面吸附抗原(或抗體)的載體微球稱(chēng)為免疫微球。特點(diǎn)：增大體積，敏感，可檢測(cè)極微量抗原。根據(jù)所用載體不同，常用的間接凝集反應(yīng)有間接血球凝集反應(yīng)，碳凝集反應(yīng)，乳膠凝集反應(yīng)等。還有間接凝集抑制反應(yīng)，三、主要抗原抗體反應(yīng)(二)、沉淀反應(yīng)定義：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在條件下，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物。（沉淀原，沉淀素）

凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)的區(qū)別：凝集反應(yīng)的抗原是顆粒性抗原，總表面積小，做抗體稀釋。沉淀反應(yīng)的抗原是可溶性的膠體溶液，單位面積抗原多，需抗體量多，抗原稀釋。

以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。類(lèi)型：環(huán)狀法、絮狀法和瓊脂擴(kuò)散法（單向和雙向）。三、主要抗原抗體反應(yīng)圖7-5瓊脂雙向擴(kuò)散的幾種不同方式結(jié)果示意圖3、免疫電泳將瓊脂擴(kuò)散和電泳技術(shù)相結(jié)合的血清學(xué)檢驗(yàn)方法。

特點(diǎn)：特異性強(qiáng)、很高的靈敏性和分辨力。用途：分析抗原或抗體純度。

類(lèi)型：對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、雙向免疫電泳、瓊脂免疫電泳。（1）對(duì)流免疫電泳這是一種將雙向擴(kuò)散與電泳技術(shù)結(jié)合而成的方法。

原理：抗原與抗體分別置于凝膠板電場(chǎng)負(fù)、正極附近的小孔中，通電后，抗原向正極移動(dòng)，而抗體則向負(fù)極移動(dòng)，結(jié)果在兩孔間合適的抗原、抗體濃度處會(huì)形成一條沉淀線(xiàn)。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和甲種胎兒蛋白(AFP)等的檢測(cè)。3、免疫電泳（2）火箭免疫電泳定義：抗原在含定量抗體的瓊脂中向一個(gè)方向泳動(dòng)，兩者比例合適時(shí)，在較短時(shí)間內(nèi)生成如火箭狀或錐狀的沉淀線(xiàn)。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。圖7-6火箭電泳結(jié)果示意圖（3）雙向免疫電泳這是一種將火箭電泳與血清免疫電泳相結(jié)合的方法定義：先將血清用電泳分離出各成分，然后切下凝膠板轉(zhuǎn)移至另一已加有抗血清的凝膠上，進(jìn)入垂直方向的第二次電泳，形成呈連續(xù)火箭樣的沉淀線(xiàn)。

圖7-7雙向免疫電泳示意圖

3、免疫電泳（4）瓊脂免疫電泳先進(jìn)行瓊脂平板電泳再做雙向瓊脂擴(kuò)散的血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。定義：先將抗原樣品在瓊脂凝膠中電泳，不同抗原成分因其遷移率的不同而分離成區(qū)帶，挖一條平行的抗體槽，加入抗血清做雙向擴(kuò)散，在兩者比例適合處形成可見(jiàn)的弧形沉淀線(xiàn)。根據(jù)沉淀線(xiàn)的數(shù)量、位置和形狀，即可分析樣品中所含的抗原成分和含量。瓊脂免疫電泳示意圖(三)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)定義：有補(bǔ)體參與，并以綿羊紅血球和溶血素(紅細(xì)胞的特異抗體)是否發(fā)生溶血反應(yīng)作指示的一種高靈敏度的抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)。原理：補(bǔ)體沒(méi)有特異性，可與任何抗原抗體復(fù)合物發(fā)生結(jié)合(即不能與單獨(dú)的抗原或抗體結(jié)合)，一旦結(jié)合后并不再游離，但不能顯示肉眼可見(jiàn)現(xiàn)象。通常應(yīng)用溶血系統(tǒng)作為指示劑，以判定補(bǔ)體是否已被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。游離補(bǔ)體，就會(huì)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的溶血反應(yīng)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)有抗原、抗體、補(bǔ)體、紅血球、溶血素5種成分參加，并分屬于反應(yīng)系統(tǒng)和指示系統(tǒng)。4、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)

圖7-9補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)示意圖

4、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（1）反應(yīng)系統(tǒng)(試驗(yàn)系統(tǒng)、結(jié)合系統(tǒng))

由已知抗原(或抗體)、被檢抗體(或抗原)和補(bǔ)體組成。先加入抗原、抗體，再加入補(bǔ)體，混合后作用一定時(shí)間。如果抗原和抗體相對(duì)應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，則補(bǔ)體就被結(jié)合，否則即為游離狀態(tài)。（2）指示系統(tǒng)(溶血系統(tǒng))由紅血球(抗原)和溶血素(抗體)組成。在反應(yīng)系統(tǒng)完畢后，再向試管內(nèi)加入綿