大鼠高尿酸血癥腎損害模型的建立

大鼠高尿酸血癥腎損害模型的建立

高尿酸血癥是指體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的代謝紊亂。如果含酸量過大或不足，血尿酸會(huì)增加，超過血漿正常濃度，細(xì)胞外液中的鈉胺量會(huì)超過飽和狀態(tài)，導(dǎo)致腎臟慢性間質(zhì)性胃炎和尿酸性腎衰竭。高尿酸血癥是痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)及特征,其并發(fā)癥是關(guān)節(jié)、皮膚、腎臟等組織器官的損害。近些年,隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人民生活質(zhì)量的提高,飲食結(jié)構(gòu)的改變,國內(nèi)外高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)生率逐年升高,并呈上升趨勢。長期高尿酸血癥導(dǎo)致腎損害和痛風(fēng),腎損害致尿酸排泄障礙。高尿酸血癥是痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)和前提,故在痛風(fēng)的防治上,高尿酸血癥與痛風(fēng)常一起討論,但至今國內(nèi)外尚無理想的治療痛風(fēng)的藥物。研制和開發(fā)治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的新藥需要有理想的動(dòng)物模型,本實(shí)驗(yàn)通過高嘌呤飲食誘導(dǎo)建立持續(xù)性高尿酸血癥并腎損害大鼠模型。1材料方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性Wistar大鼠。體重(210±10)g購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2aldrcket3.1.腺嘌呤(Adenine),批號(hào)000606,Sig2購自Sigma,氧嗪酸鉀鹽(oxonicacid,potassiumsalt0.97EC218-720-7)美國Aldrich公司。1.3腎組織病理學(xué)檢測血尿酸(UA),尿素氮(BUN),肌酐(CR)用黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)Beckman生化分析儀測定指標(biāo),腎組織病理及超微病理。1.4腎組織病理學(xué)檢測將128只雄性大鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組32只,每組動(dòng)物自由飲食1周,將不同配比的造模藥溶于3mL蒸餾水中。見表1。分別給3個(gè)劑量組大鼠灌胃,對(duì)照組灌服等劑量的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)共計(jì)21天,實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)后第7日及第14日每組隨機(jī)抽取8只股動(dòng)脈取血,分離血清,實(shí)驗(yàn)后第21日,每組取8只股動(dòng)脈取血,分離血清,處死,取雙腎。組織標(biāo)本用無水酒精固定,各組腎臟均用石蠟包埋,切片,HE染色。光鏡下觀察大鼠腎組織一般形態(tài),包括被膜,腎小球,腎間質(zhì),腎曲小管等。超微病理的腎臟標(biāo)本以6%戊二醛磷酸緩沖液固定,丙酮脫水,環(huán)氧丙烷過濾,Epon812樹脂浸透與包埋,LKB2V型超薄切片機(jī)切片,醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色,H600-2電鏡觀察,照相。1.5統(tǒng)計(jì)方法測定結(jié)果以(x±s)表示,運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行組間方差分析。2結(jié)果2.1實(shí)驗(yàn)前對(duì)血清尿液氮基因進(jìn)行測定差異均無顯著性(P>0.05),見表2。2.2血清尿酸水平結(jié)果見表3。低、中、高3個(gè)劑量組血清尿酸水平均有不同程度的升高。低劑量組血清尿酸水平第7、14、21日逐漸升高,所測得的血尿酸結(jié)果于各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);中、高劑量組第7、14、21日血清尿酸水平較對(duì)照組明顯升高,其變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2.3血尿素氮、胱肌檢測結(jié)果見表4。低、中、高3個(gè)劑量組在第7、14、21日血尿素氮、肌酐均增高,其中高劑量組增高最顯著,低、中、高3個(gè)劑量組在第7,14,21日血尿素氮、肌酐水平與對(duì)照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2.4組織病理學(xué)的改變2.4.1胞排列特征正常對(duì)照組腎小管結(jié)構(gòu)清晰,小球正常大小;模型低劑量組腎小管上皮細(xì)胞排列不規(guī)則,細(xì)胞空化;模型中劑量組腎小管局灶性萎縮,炎細(xì)胞浸潤,腎小管上皮細(xì)胞胞漿空泡,細(xì)胞空化,小管內(nèi)少量尿酸鹽結(jié)晶;模型高劑量組腎小管擴(kuò)張,細(xì)胞間質(zhì)纖維化,小管內(nèi)可見大量尿酸鹽結(jié)晶。2.4.2各組小鼠初始酶體的變化正常對(duì)照組腎近曲小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞表面微絨毛形態(tài)規(guī)則;模型低劑量組腎小管上皮細(xì)胞溶酶體輕度增生,小管間質(zhì)纖維母細(xì)胞增多;模型中劑量組近曲小管微絨毛明顯減少或脫失,上皮細(xì)胞核輕度固縮,溶酶體增生,線粒體膜不完整、嵴溶解或斷裂;模型高劑量組近曲小管微絨毛消失,部分上皮細(xì)胞核固縮,胞漿內(nèi)細(xì)胞器減少,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊不清,腎小管管腔內(nèi)可見大量尿酸鹽結(jié)晶。3基于氧嗪酸鉀的高尿酸特殊損害模型的制備由于人類缺乏尿酸酶,尿酸是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物,大部分嘌呤物質(zhì)都以尿酸形式排出體外,而其他大多數(shù)低等哺乳類動(dòng)物如鼠、熊、馬等體內(nèi)可分泌尿酸酶,可將尿酸降解為尿囊素,而尿囊素為無毒物質(zhì),水溶性良好極易隨尿排出體外。因此建立高尿酸血癥的動(dòng)物模型如果能消除人類和造模動(dòng)物之間的在尿酸酶上的差異,建立一個(gè)與人類機(jī)體內(nèi)環(huán)境相似的高尿酸血癥動(dòng)物模型對(duì)高尿酸血癥及痛風(fēng)的科學(xué)研究具有重要意義。美國WU等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得尿酸酶缺乏的突變小鼠,但這種小鼠壽命甚短,且費(fèi)用高,推廣困難。與人類相同雞體內(nèi)也缺乏尿酸酶、尿酸為嘌呤最終代謝產(chǎn)物,但雞屬禽類,與人類又有較大的種屬上的差異,其應(yīng)用具有局限性。為了使所造模型更具有實(shí)用性,筆者選擇大鼠做為造模對(duì)象,大鼠的優(yōu)點(diǎn)為:繁殖力強(qiáng)、易飼養(yǎng)、體型大小合適、給藥容易、且較經(jīng)濟(jì),適用于進(jìn)行藥物毒理、藥效評(píng)價(jià)、及新藥篩選等多方面的實(shí)驗(yàn)研究,為解決其在尿酸酶方面與人類的差異,在造模藥品上應(yīng)用腺嘌呤加尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀,氧嗪酸鉀通過抑制尿酸酶來減少尿酸分解,從而造成與人類相似的生物內(nèi)環(huán)境。在許多文獻(xiàn)報(bào)道中尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀均是加在飼料中以飼喂的途徑給予大鼠,考慮到大鼠個(gè)體間食量不均,且在造模的過程中大鼠機(jī)能損害逐漸加重,食量變化等因素會(huì)影響到氧嗪酸鉀的攝入量,本實(shí)驗(yàn)采用氧嗪酸鉀同腺嘌呤灌胃的方法,避免了上述的弊端,并成功制備了高尿酸血癥腎損害模型。筆者認(rèn)為以下兩個(gè)