兩個鹽單胞菌屬菌株的生物學(xué)特性分析

兩個鹽單胞菌屬菌株的生物學(xué)特性分析

嗜鹽菌是一種不同于舊細(xì)胞菌的極端環(huán)境微生物，可以在含有0.32%nacl的環(huán)境中生長。在20世紀(jì)80年代，分類混亂。只有海生作為一個獨(dú)特的平均嗜鹽菌，其中一個是在威迪先后從鹽生廠發(fā)現(xiàn)的，稱為海生嗜鹽菌。此后，許多中度嗜鹽菌被劃分為其他物種，如德萊士菌、假單胞菌和假單胞菌。隨著中度嗜鹽菌分類的推進(jìn)，許多相關(guān)品種被劃分為相應(yīng)的科和屬。根據(jù)對16種順序性遺傳多樣性和耐鹽基因的一般分析，dubson等人將單胞菌科分為體針菌科，而德萊士菌和鹽弧菌被歸類為單胞菌科。由于中度嗜鹽菌具有廣泛的適應(yīng)性，因此許多其他生物所不具有生理特征，因此具有研究和應(yīng)用價值。近年來，中國有幾篇報道，對遺傳多樣性和耐鹽基因的克隆進(jìn)行了研究和報道。在這項(xiàng)工作中，我們報道了從青島附近生產(chǎn)海生物鹽的鹽漬中分離出的兩類中度嗜鹽菌cm1和cm4的生理生化特性以及物種分化情況。1材料和方法1.1培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法菌株CM1和CM4由青島附近所產(chǎn)海產(chǎn)品的鹽漬中分離得到.富集和分離培養(yǎng)基采用CM培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)在250mL三角瓶中裝50mL溫培養(yǎng)基,37℃搖床培養(yǎng)(220r/min).固體培養(yǎng)于加了少量蒸餾水的塑料袋中,培養(yǎng)兩周后挑選單菌落,反復(fù)劃線,直至獲得純菌.分離之后的培養(yǎng)均采用ATCC213培養(yǎng)基(g/L:MgSO4·7H2O10,KCl5,CaCl2·6H2O0.2,酵母提取物10,Tryptone2.5,NaCl180),37℃,搖床振蕩培養(yǎng)(120r/min);固體培養(yǎng)基加瓊脂18～20g/L,pH7.0,倒置平板培養(yǎng),溫度37℃.1.2菌體形態(tài)觀察CM1和CM4在ATCC213液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后,用相差顯微鏡觀察活菌體,革蘭氏染色及電子顯微鏡等方法確定菌體形態(tài).牛奶—鹽—瓊脂平板劃線,37℃暗箱培養(yǎng)幾天后觀察菌落形態(tài)特征.1.3測量1.3.1生長條件用液體培養(yǎng)基接種并計時,一定時間間隔取樣,耐鹽試驗(yàn)時測OD460nm;最適Mg2+時測OD540nm.1.3.2薄層層析對于rf值的影響取30mL細(xì)菌培養(yǎng)液,離心(3500r/min)收集菌體,真空干燥后裝入試管,分別加入3mL甲苯,3mL甲醇和0.1mL濃硫酸,于50℃水浴中水解15h,取上清液20μL進(jìn)行薄層層析(層析板用1.7g硅膠溶于10mL0.5%的羧甲基纖維素鈉倒板,于110℃活化1h)測定Rf值.1.3.3培養(yǎng)基od值的測定采用不同濃度NaCl梯度的ATCC213液體培養(yǎng)基,37℃搖床振蕩培養(yǎng)CM1和CM42～7天,用7320型分光光度計于460nm測OD值.1.3.4抗菌素的篩選將分別浸有青霉素、四環(huán)素、潮霉素、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素和利福平等抗生素的厚濾紙片放在預(yù)先涂布好細(xì)菌的培養(yǎng)基上,于37℃培養(yǎng)CM15天,CM42天后,觀察抗菌素對它們有無抑制作用.1.3.5菌懸液的制備將Mg2+按以下濃度梯度加入CM培養(yǎng)基中:15,20,25,30,35,40,45,50,55,60mmol/L.接入菌種,于37℃在搖床上震蕩培養(yǎng)5天.測所得菌懸液的OD540nm值.1.3.6其他生理生化特征方法參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的方法.1.3.7蒸餾水處理將細(xì)菌培養(yǎng)液離心,棄上清液,加蒸餾水搖勻,觀察粘度或鏡檢.2結(jié)果2.1革蘭氏染色陰性菌株bCM1和CM4均為桿狀,大小分別為(0.3～0.4)μm×(2.1～3.2)μm和(0.6～0.7)μm×(1.0～2.0)μm,革蘭氏染色陰性,但CM1具有鞭毛,不能運(yùn)動,而CM4則具有一根鞭毛,能夠運(yùn)動(圖1a,b).兩者的菌落均為乳白色,表面光滑,濕潤,兩面顏色一致,邊緣整齊.CM1培養(yǎng)3天后菌落大小為1mm,而CM4培養(yǎng)1天即可達(dá)1mm.2.2.1cm1和cm4的生長CM1的最適生長pH值為9.0,而CM4的最適生長pH值為7.7;最適Mg2+濃度,CM1為60mmol/L,CM4為40mmol/L.在NaCl低于2%的情況下,CM1和CM4需要在Mg2+濃度達(dá)到50mmol/L時才能夠生長;在NaCl濃度為10%的情況下,CM1還需要Mg2+濃度達(dá)到45mmol/L才能生長,而對CM4而言,只需要有15mmol/L的Mg2+濃度就可以生長.在最適生長條件下,CM1的對數(shù)生長期出現(xiàn)在70h左右,而CM4在20h左右.對兩個菌株長時間(>10天)進(jìn)行培養(yǎng),CM1在達(dá)到吸光度為0.7左右時即不再增加,而CM5則會持續(xù)生長,并出現(xiàn)絮凝狀沉淀,最終菌液變?yōu)楹稚霈F(xiàn)細(xì)菌的大量死亡.2.2.2鹽濃度不適宜生長CM1和CM4的最適NaCl濃度均為12%,在鹽濃度低于2.5%時不生長,但明顯可見的是CM1的生長速度要低于CM4(圖2).兩個菌株經(jīng)過蒸餾水處理之后均不發(fā)生破裂.2.2.3不穩(wěn)定因素:四環(huán)素、潮霉素不敏感,對四環(huán)素、潮霉素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對潮霉素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對潮霉素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對潮霉素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對潮霉素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對潮霉素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對潮霉素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對四環(huán)素不敏感,對潮霉素CM1對鏈霉素、紅霉素、氯霉素、利富平、氨芐青霉素、卡那霉素敏感,對四環(huán)素和潮霉素不敏感;CM4對氨芐青霉素、四環(huán)素、潮霉素、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素不敏感,且在四環(huán)素中生長更旺,對氯霉素和利富平敏感.2.2.4甘油二醚衍生物的斑射法檢測薄層層析結(jié)果分析表明,CM1和CM4沒有區(qū)別,均未呈現(xiàn)甘油二醚衍生物的斑點(diǎn),而具有非羥基化的脂肪酸甲酯斑點(diǎn),即遷移率均大于0.6,而對照的嗜鹽古細(xì)菌的遷移率約為0.2(見圖3).2.2.5糖酸類的碳源在所測試的有機(jī)物當(dāng)中,包括半乳糖,蔗糖,纖維二糖,甘露糖,葡萄糖,果糖,乳糖,葡聚糖,鼠李糖,甘露醇,肌醇,山梨醇,CM1僅能利用果糖作為惟一碳源生長;而CM4可以分別利用甘露糖,鼠李糖和乳糖作為惟一碳源生長.2.2.6淀粉的制備在所進(jìn)行的其他生理生化實(shí)驗(yàn)中CM1和CM4均表現(xiàn)一致:不水解淀粉,不液化明膠,不生成H2S;氧化酶和接觸酶陰性,吲哚實(shí)驗(yàn)陰性,而尿酶、過氧化氫酶和精氨酸雙水解酶陽性,硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)陽性.3新種和配種的可能是cm4的生物進(jìn)化產(chǎn)物上述試驗(yàn)結(jié)果表明,CM1和CM4菌株的特征符合鹽單胞菌屬的特征,即能在含2.5%～25%NaCl的培養(yǎng)基中生長,其最適NaCl濃度為12.5%,且在蒸餾水中不發(fā)生自溶,細(xì)胞膜含非羥基化的脂肪酸甲酯,而不含甘油二醚衍生物.為革蘭氏陰性桿菌,菌落白色,不含色素.經(jīng)與該屬已知的7個種相比較(表1),發(fā)現(xiàn)與這兩個菌株的生理生化特征有著顯著的差異,因而有可能是新種.當(dāng)然,這還有待于DNA雜交以及16SrDNA序列分析以后才能最終作出結(jié)論.就這兩個菌株而言,它們在大多數(shù)生理生化特征上相似,僅在運(yùn)動性、菌體大小、對Mg2+的需求、藥敏實(shí)驗(yàn)以及對有機(jī)物的利用上有所差異,這表明兩個菌株在系統(tǒng)分類上親緣關(guān)系非常接近,甚或就是一個菌種的不同亞種或生態(tài)型.考慮到其生存的特殊環(huán)境,其分化可能是微生物在進(jìn)化穩(wěn)定策略選擇上的不同造成的,即CM1可能屬于K-對策者,其菌體較大,生長緩慢,不能運(yùn)動,群體發(fā)育到一定程度后即停滯.與此相反,CM4菌體較小,生長迅速,能運(yùn)動,種群發(fā)育無節(jié)制,因而可能采用了r-對策.