第六章 細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)

第五章細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)第一節(jié)、培養(yǎng)細(xì)胞的

取材和分離一、培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作（1）培養(yǎng)前的準(zhǔn)備（2）培養(yǎng)室和超凈臺的消毒（3）洗手和著裝（4）無菌培養(yǎng)操作二、培養(yǎng)細(xì)胞的取材（1）取材的基本要求A、取材的組織最好盡快培養(yǎng)。B、取材時應(yīng)嚴(yán)格無菌消毒。C、取材和原代培養(yǎng)時要用鋒利的器械如手術(shù)刀片切碎組織，盡量減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷。二、培養(yǎng)細(xì)胞的取材（1）取材的基本要求D、對于血液、脂肪、結(jié)締組織和壞死組織等，取材時要細(xì)心除去。E、胚胎組織較成熟個體的組織容易培養(yǎng)，分化地的較分化高的組織容易生長，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。二、培養(yǎng)細(xì)胞的取材（2）組織材料的分離目前常用分散組織的方法有機(jī)械法和化學(xué)法兩種二、培養(yǎng)細(xì)胞的取材（2）組織材料的分離A、細(xì)胞懸液的分離方法如材料為血液、羊水等細(xì)胞懸液時，一般采用低速離心方法。（2）組織材料的分離B、組織塊的分離方法a、機(jī)械分散法（2）組織材料的分離B、組織塊的分離方法b、剪切分離法（2）組織材料的分離B、組織塊的分離方法c、消化分離法消化法是結(jié)合生化和化學(xué)手段把已剪切成較小體積的組織進(jìn)一步分散的方法。胰蛋白酶法、膠原酶法、EDTA法三、細(xì)胞的計數(shù)血球計數(shù)板16中格×25小格計算公式：

細(xì)胞數(shù)/ml=100小格內(nèi)細(xì)胞個數(shù)/100×400×10000×稀釋倍數(shù)25中格×16小格計算公式：

細(xì)胞數(shù)/ml=80小格內(nèi)細(xì)胞個數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù)在計數(shù)時，對沉降在格線上的細(xì)胞的統(tǒng)計應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。如細(xì)胞位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細(xì)胞計入本格，本格的下線和右線上的細(xì)胞按規(guī)定計入相應(yīng)的格中。第二節(jié)原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)：是從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。原代培養(yǎng)分為：一、組織塊培養(yǎng)法二、消化培養(yǎng)法三、器官培養(yǎng)法一、組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)法是常用的、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。即將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶。一、組織塊培養(yǎng)法

步驟：1、取材修剪沖洗2、剪成1mm3左右的小塊3、移入培養(yǎng)瓶4、間距5mm分布組織小塊5、翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶37℃靜止1-2h6、翻正培養(yǎng)瓶培養(yǎng)7、原代細(xì)胞培養(yǎng)一、組織塊培養(yǎng)法

二、消化培養(yǎng)法1、消化分離法消化細(xì)胞2、鏡檢，發(fā)現(xiàn)組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞，終止消化，篩網(wǎng)過濾，大塊繼續(xù)消化。3、過濾的消化液，低速離心，加培養(yǎng)液，細(xì)胞計數(shù)后，接入培養(yǎng)瓶。第三節(jié)傳代培養(yǎng)和

細(xì)胞系的維持傳代培養(yǎng)的原因？原代培養(yǎng)后，由于細(xì)胞數(shù)量增加，整個培養(yǎng)器皿，逐漸被細(xì)胞覆蓋，如果不進(jìn)行傳代培養(yǎng)細(xì)胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生長。一、原代培養(yǎng)的首次傳代傳代：細(xì)胞由原代培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱為傳代。二、細(xì)胞傳代方法1、貼壁細(xì)胞的消化法傳代二、細(xì)胞傳代方法1、貼壁細(xì)胞的消化法傳代（1）吸出或倒掉瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液。（2）加入適量的消化液消化。（3）鏡檢，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化（4）吹打瓶壁細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液（5）技術(shù)，接種到新的培養(yǎng)瓶。二、細(xì)胞傳代方法1、懸浮細(xì)胞的傳代懸浮細(xì)胞多采用離心方法傳代，即將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，800-1000rpm離心5min,然后取出上清，加入新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打使之形成細(xì)胞懸液，然后傳代接種。細(xì)胞系的維持是通過換液，傳代，再換液、再傳代和細(xì)胞凍存實現(xiàn)的。三、培養(yǎng)細(xì)胞的維持細(xì)胞系的維持注意的要點(diǎn)：1、細(xì)胞系檔案要記錄好。2、細(xì)胞系的傳代、換液一般都有自身的規(guī)律性，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性。3、多種細(xì)胞系維持傳代，要嚴(yán)格操作程序，以防細(xì)胞之間交叉污染。4、每一種細(xì)胞都應(yīng)有充足的凍存儲備。四、細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)檢查1、檢查營養(yǎng)液的pH值。新鮮培養(yǎng)液呈橙紅色（pH7.2）細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)積累增多，營養(yǎng)液酸化變黃，