第3章-基因克隆載體

第三章基因克隆載體第一節(jié)基因克隆載體的特點與分類1基因克隆載體的含義及特點含義：能夠把外源DNA片段帶入受體細胞并進行穩(wěn)定遺傳的DNA或RNA分子．

MCSMarkerForeigngene基因克隆載體的特點具備與外源DNA片段連接和重組的克隆位點．進入受體細胞后能穩(wěn)定存在于細胞質(zhì)中或與染色體整合在一起．在宿主細胞或受體細胞中自我復(fù)制或隨整合的受體細胞染色體DNA一起復(fù)制．外源基因能在受體細胞中表達．克隆載體進入細胞后有可供選擇標記．２克隆載體的分類質(zhì)粒載體大腸桿菌質(zhì)粒載體，枯草桿菌質(zhì)粒載體，酵母質(zhì)粒載體，農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體，藍細菌質(zhì)粒載體噬菌體質(zhì)粒載體雙鏈DNA噬菌體載體：λ單鏈DNA噬菌體載體：M13，T3，T7病毒載體植物病毒載體CaMV（花椰菜花斑病病毒）動物病毒載體SV40（猿猴空泡病毒）2.1按構(gòu)建克隆載體DNA的來源分類質(zhì)粒和噬菌體DNA兼有的載體

Phasmid

載體（含有f1噬菌體的ori）

Cosmid

載體（含有λDNA的Cos區(qū)）染色體和質(zhì)粒DNA兼有的載體（Chrosmidvector）基因整合平臺系統(tǒng)ＹＡＣ克隆載體其它克隆載體2.2按克隆載體的用途分類

cDNA克隆載體：λgt11，pT7T3

原核（Prokaryotic）表達載體：pKK223-3

原核基因融合（Prokaryoticgenefusion）載體：

pGEX-2T，pGEX-3X

真核（Eukaryotic）表達載體：pSVK3，pBPV

轉(zhuǎn)錄（Transcription）載體：pSL1190

普通載體（Generalvector）：pBR322，pUC18第二節(jié)質(zhì)?？寺≥d體１質(zhì)粒載體的一般特性質(zhì)粒是一種廣泛存在于細菌細胞中染色體以外的能自主復(fù)制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對細菌的質(zhì)粒研究得比較深入。質(zhì)粒載體的一般特性質(zhì)粒的組成與構(gòu)型細胞內(nèi)：超螺旋環(huán)狀共價雙鏈DNA分子細胞外：超螺旋、開環(huán)，線形雙螺旋共價閉合環(huán)（超螺旋）開環(huán)雙螺旋（一個裂口）線狀雙螺旋（兩個裂口）質(zhì)粒DNA分子的大?。杭毦|(zhì)粒的大小相差較大，小的僅不足1kb，大的可達數(shù)百kb.不相容性（Incompatible）：兩種類似的但又不同的質(zhì)粒不能存在于同一細胞中．可轉(zhuǎn)移性：質(zhì)粒可通過接合作用等方式轉(zhuǎn)移到新的宿主細胞中．復(fù)制性：質(zhì)粒DNA分子只在宿主細胞內(nèi)進行單向復(fù)制，其復(fù)制受質(zhì)粒本身和宿主細胞遺傳系統(tǒng)的雙重控制，質(zhì)粒提供復(fù)制的起始位點和核苷酸的序列．6）相關(guān)基因

A）COP因子：決定質(zhì)粒的拷貝數(shù)，在質(zhì)粒的復(fù)制過程中指令細胞合成阻物，當質(zhì)粒復(fù)制到一定的拷貝時，阻物的量也積累到足以阻止質(zhì)粒的復(fù)制．B）Rep基因：在質(zhì)粒的復(fù)制過程中，Replication基因會指令宿主細胞合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進質(zhì)粒的復(fù)制．C）Inc基因：決定兩種親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒不能存在于同一宿主細胞中．D）Tra基因：指令宿主細胞合成菌毛（Pilus）和細胞表面物，促使宿主細胞與受體細胞表面結(jié)合，遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移．E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr．F）產(chǎn)毒素基因：大腸桿菌素基因（Col-質(zhì)粒）．G）降解基因：降解重金屬、有機物和農(nóng)藥等．H)致瘤基因：誘導(dǎo)某些組織形成腫瘤，如Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒．

２幾種常見的質(zhì)粒載體１）pBR322：含有雙抗基因（Apr，Tcr）ColE1復(fù)制起始子2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和復(fù)制的起始點，部分缺失的Lac操縱子片段，并在LacZ’區(qū)組裝了MCS．

pUC18-19多克隆位點3）pBluescriptM13：含有M13噬菌體DNA復(fù)制起點的載體，該起點以互為相反方向插入到含有T3和T7噬菌體啟動子的一個來自pUC質(zhì)粒的載體當中．

pBluescriptM13多克隆位點4）Ti質(zhì)粒載體病毒區(qū)基因及功能Ti質(zhì)粒T-DNA的邊界序列３質(zhì)粒載體的構(gòu)建1）構(gòu)建的質(zhì)粒載體能轉(zhuǎn)化受體細胞,并在其中進行松弛型復(fù)制.*選擇松弛型質(zhì)粒復(fù)制起始子(Ori)2)構(gòu)建的質(zhì)粒載體含有克隆外源DNA的位點(MCS)*構(gòu)建的質(zhì)粒載體含有選擇標記基因(Apr,Tcr,Kmr)*構(gòu)建的質(zhì)粒載體分子量小,轉(zhuǎn)化效率高,插入外源片段較大.3.1質(zhì)粒構(gòu)建的基本要求3.2pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建３.3pUC18-19質(zhì)粒載體的構(gòu)建以pBR322為出發(fā)質(zhì)粒，用含乳糖操縱子O、P和Z’的DNA片段取代pBR322上的Tcr基因，并在Z’區(qū)組入一個多克隆位點．pUC18-19的構(gòu)建3.４藍藻質(zhì)粒載體的構(gòu)建

藍藻作為受體細胞的特點a）原核生物，能進行光合作用，具有固氮能力．b）基因組簡單，50%的藍藻含有質(zhì)粒．c）細胞大（10-10于E.coli）儲藏蛋白多，單一蛋白可達25%，而大腸桿菌僅為5%．d）蛋白更新慢，容受性比較大e）蛋白酶的降解作用比較低，產(chǎn)物比較均一．

藍藻質(zhì)粒的特點a）雙向載體（需要兩種Ori）．b）合適的選擇標記．c）分子大小合適．d）拷貝高．藍藻質(zhì)粒載體pAQE17的構(gòu)建3.５農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建設(shè)計原理:保留T-DNA兩側(cè)的邊界序列,插入選擇性標記,除去致瘤基因和無關(guān)基因.共整合質(zhì)粒載體:將T-DNA區(qū)段編碼致瘤基因和冠癭堿合成酶的基因由pBR322上的一段DNA片段取代,當攜帶目的基因片段的pBR322衍生中間載體進入農(nóng)桿菌細胞后,兩者相同的pBR322序列之間發(fā)生同源交換,導(dǎo)致外源目的基因片段整合到Ti質(zhì)粒上.外源片段共整合到Ti質(zhì)粒上的過程雙向載體：由兩個以上的質(zhì)粒構(gòu)建而成.將Ti質(zhì)粒的Vir與廣宿主范圍質(zhì)粒的攜帶目的基因(MCS)、選擇性標記、轉(zhuǎn)移和復(fù)制功能整合在一起.雙向載體可在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中進行復(fù)制并穩(wěn)定存在下去．雙向Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建第三節(jié)噬菌體衍生的克隆載體１.1λ噬菌體的一般特性

λ噬菌體的組成結(jié)構(gòu)：外殼蛋白DNA形態(tài)：頭部尾部１λ噬菌體克隆載體λ噬菌體的電子顯微鏡照片a)在噬菌體內(nèi)呈線性雙鏈DNA分子(48502bp)在兩端各有12個堿基組成的5’單鏈互補粘性末端(Cohesiveend),進入宿主細胞后,粘性末端連接形成環(huán)狀分子(Cos位點)．5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’b)λ基因組DNA上有多種限制酶識別位點．c)λ噬菌體包裝DNA的大小為原λDNA長度的75-105%(38-54kb)．λ基因組DNA的特點1.2λ基因組DNA的結(jié)構(gòu)

噬菌體的組裝1.3λ噬菌體載體構(gòu)建的策略a)去除部分限制酶識別位點b)去除非必需區(qū)DNAc)插入可供選擇的標記基因常用的λ噬菌體衍生載體載體名稱分子大小(kb)可克隆外源DNA片段大小(kb)Charon3A4.830–21.4Charon4A4.540–20.1Charon174.640-22.4Charon2040.360–21.37Charon21A41.70–21.08Charon2839.390–20.05Charon3046.760-20.24LA7–140.60–24.1Sep6-lac544.30–22.4BF10146.06.3–24.42.Cosmid克隆載體2.1Cosmid載體的特點a)兼有λ噬菌體和質(zhì)粒載體的特點．含有λ噬菌體Cos位點(可進行體外包裝)和細菌質(zhì)粒載體的復(fù)制子(選擇標記,可在細菌中保存和大量復(fù)制)．b)可插入大片段外源DNA．2.2部分Cosmid載體Cosmid載體復(fù)制子分子量(kb)選擇標記克隆位點克隆能力(kb)C2XBpMB16.8Apr,Kmr

BamHI,ClaI,EcoRI32-45

HindIII,PstI,SmaIpHC79pMB16.4Apr,Tcr

EcoRI,HindIII,SalI29-46

BamHI,PstI,CalIpHS262ColE12.8Kmr

BamHI,EcoRI,HincII34–46pJC74ColE115.8Apr

EcoRI,BamHI,SalI21–37pJB8ColE15.4Apr

BamHI,HindIII,SalI31–47MUA-3pMBI4.8Tcr

PstI,EcoRI,BalI32-48pTL5pMBI5.6Tcr

BgalI,BalI,HpaI31–47pMF7pMBI5.4Apr

EcoRI,SalI32–483.M13衍生的克隆載體3.1M13噬菌體的特點*環(huán)狀單鏈DNA(6407堿基),可轉(zhuǎn)導(dǎo)E.coli*含有基因間隔區(qū)(IS-Intersequence)*具有轉(zhuǎn)染作用(E.coli)3.2M13DNA的復(fù)制與M13噬菌體的增殖a)M13噬菌體吸附在大腸桿菌表面F性毛上,M13ss-DNA(+鏈)進入細胞．b)在宿主細胞內(nèi)以+鏈為模板合成大量的-DNA鏈,成為雙鏈復(fù)制型DNA(RF-DNA),同時在宿主細胞內(nèi)合成大量的特異性蛋白與+鏈DNA結(jié)合．c)RF-DNA以-DNA為模板不斷合成+鏈DNA,與特異性蛋白結(jié)合,組裝成新的噬菌體顆粒.釋放到細胞外,而不破壞宿主細胞．3.3M13衍生的克隆載體第四節(jié)植物病毒載體1.花椰菜花斑病病毒（CauliflowerMosaicVirus,CaMV)．

環(huán)狀雙鏈DNA病毒，由蚜蟲以非持久方式或半持久方式傳播、感染十字花科和少數(shù)非十字花科植物

1）CaMV-DNA的一般特性環(huán)狀雙鏈DNA（8031bp），在病毒顆粒中以開環(huán)的形式存在，分別在-鏈上有一個缺口(

1），+鏈上有兩個缺口（

2，

3），在缺口中形成三鏈結(jié)構(gòu)．花椰菜花斑病病毒DNA缺口的結(jié)構(gòu)缺口1：GAATTTTTTAA5’3’GCATTTTTTAA5’5’CGCTTAAAAAATT3’缺口2：5’GGTTGATTACTCGAGCC5’GGTTGATTACTCGAGAA3’3’CCAACTAATGAGCTCGGTT5’缺口3：5’TCCAATAGTCTTCTTTTTCAG5’TCCAATAGTCTTCTTTTTGAA3’3’AGGTTATCAGAAGAAAAACTCTT5’CaMVDNA分子上有八個開放閱讀框（ORF)和三個間隔區(qū)．ORFI：編碼運動蛋白，負責CaMV在細胞間運轉(zhuǎn)．ORFII：表達產(chǎn)物與蚜蟲口針或前腸的特殊位點相結(jié)合，參與蚜蟲的感染．ORFIII：編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白．ORFIV：編碼反轉(zhuǎn)錄酶．2)CaMV基因區(qū)病毒增殖缺口閉合侵染編碼病毒反轉(zhuǎn)錄酶，35S反轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)癥狀和宿主范圍編碼外殼蛋白

花椰菜花斑病病毒基因組DNA的結(jié)構(gòu)3)CaMVDNA的間隔區(qū)IR1：位于ORFVI和ORFVII之間，長度為700bp，含有啟動轉(zhuǎn)錄35SRNA的啟動子．IR2：位于ORFVII和ORFI之間，長度為60bp．IR3：位于ORFV和ORFVI之間，長度為60bp，含有啟動19SRNA轉(zhuǎn)錄的啟動子．CaMV35S啟動子序列4）CaMV-DNA限制性內(nèi)切酶識別位點在CaMV-DNA的非必需區(qū)（II區(qū)和VII區(qū)）含有限制酶識別位點（如BstEII和XhoI），這些單酶切位點可用于插入外源DNA片段．CaMV（CabbB-S）DNA的部分酶切位點5）CaMV-DNA的存在狀態(tài)與感染能力

DNA狀態(tài)傷口感染CaMV+CaMV-DNA+CaMV-DNA-單酶切+CaMV-DNA-雙酶切5%CaMV-DNA-雙酶切-插入DNA-CaMV-DNA+克隆載體-6）CaMV的轉(zhuǎn)錄復(fù)制與CaMV的增殖7)CaMV-DNA克隆載體的構(gòu)建

基本策略和要求

*利用病毒對宿主細胞感染的特性*利用DNA分子上的單酶切位點*替換非必需區(qū)*高拷貝地存在于植物細胞中互補載體系統(tǒng)由缺陷型CaMV-DNA分子(攜帶外源目的基因)+輔助CaMV-DNA分子(攜帶缺陷型感染所需的基因)共同感染進入植物細胞并表達缺點:突變體之間發(fā)生重組,重新產(chǎn)生野生型CaMV混合載體系統(tǒng)將CaMV-DNA整合到Ti質(zhì)粒DNA分子上,使新的載體同時具有CaMV和Ti載體的特性.通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到植物細胞中.

特點:*擴大了CaMV的正常宿主范圍*避免了CaMV突變體之間的基因重組2.煙草花葉病毒（TMV)克隆載體煙草花葉病毒為短桿狀，基因組為單鏈＋RNA，長為6395個堿基，包括四個閱讀框．ORF1：編碼126kD蛋白質(zhì)，參與病毒復(fù)制．ORF2：編碼183kD蛋白質(zhì)，參與病毒復(fù)制．ORF3：編碼移動蛋白（MP)，分子量（30kD）ORF4：編碼病毒外殼蛋白（CP,17.5kD）TMV的結(jié)構(gòu)特征TMV克隆載體構(gòu)建的策略

第五節(jié)動物病毒基因克隆載體

1.猿猴空泡病毒40（Simianvirus40，SV40)1)SV40DNA的一般特性SV40DNA為環(huán)狀雙鏈DNA（5243bp），與宿主細胞組蛋白H4，H2A，H2B和H3結(jié)合，組成念珠狀核小體-微型染色體（mini-chromosome）

SV40DNA編碼兩個基因區(qū)，早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)，分別以相反的方向轉(zhuǎn)錄SV40基因轉(zhuǎn)錄圖SV40DNA單識別位點限制性內(nèi)切酶位點限制性內(nèi)切酶識別位點

KpnI294

NaeI343

HpaII346

HaeII832

EcoRI1782

BamHI2533

BstXI2759

TaqI4739

BglI52352）SV40-DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制與增殖

SV40感染并進入細胞

病毒DNA進入細胞核進行早期轉(zhuǎn)錄，合成T抗原啟動病毒DNA復(fù)制

晚期轉(zhuǎn)錄，合成包裝蛋白

組裝成病毒顆粒，細胞裂解3）SV40DNA衍生的克隆載體的構(gòu)建構(gòu)建SV40DNA衍生克隆載體的策略a)保留完整的T-抗原基因.b)保留復(fù)制起始點(Ori),間隔區(qū)和終止序列c)替換晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因.SV40DNA晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)取代型載體SVGT5-RG---SV40病毒晚期區(qū)段取代載體重組病毒質(zhì)粒