第四章 抗體制藥2

第四節(jié)抗體工程抗體研究進(jìn)展分3個(gè)階段：①1890年發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，其特點(diǎn)是用免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體；（人工免疫動(dòng)物）②1975年以雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體；（細(xì)胞融合技術(shù)）③1994年基因工程方法制備抗體；（噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)）抗體工程是在完全用基因工程技術(shù)制備人源性抗體，以及利用基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)技術(shù)，通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體的過(guò)程中發(fā)展起來(lái)的。抗體工程是指利用重組DNA和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對(duì)抗體基因進(jìn)行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后，表達(dá)抗體分子，或用細(xì)胞融合、化學(xué)修飾等方法改造抗體分子的工程。

20世紀(jì)80年代中期，Smith在前人對(duì)絲狀噬菌體分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上首先提出了噬菌體展示技術(shù)。由于該技術(shù)具有生產(chǎn)人抗體的潛力，因此，吸引了許多學(xué)者投入這一研究中，使得噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)得以迅速發(fā)展，并由此開(kāi)創(chuàng)了一條簡(jiǎn)便、快速的基因工程抗體生產(chǎn)路線。建抗體庫(kù)的目的是篩選出各種特異性的抗體分子，噬菌體抗體庫(kù)在這方面有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。噬菌體抗體庫(kù)在理論上人們可以用基因工程方法研制任何一種具有高度特異性的抗體，使抗體工程的設(shè)想成為現(xiàn)實(shí)。

Winter等在1994創(chuàng)建了噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，克服了人體不能隨意免疫的缺點(diǎn)，用人的外周血制備抗體文庫(kù)，從而獲得人源性基因工程抗體，并且將抗體基因的克隆和表達(dá)融為一體，同在一種載體上進(jìn)行，將抗體基因表達(dá)在載體（噬菌體）的表面，用固相化抗原對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的載體進(jìn)行淘篩(panning)，在數(shù)日內(nèi)就可篩選出陽(yáng)性克隆，從而能構(gòu)建出大庫(kù)容（108）文庫(kù)，囊括天然全套抗體基因。

一、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本方法

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增出抗體的全套可變區(qū)基因，通過(guò)噬菌體表面展示技術(shù)，將Fab段或單鏈抗體（ScFv）表達(dá)在噬菌體表面，經(jīng)過(guò)“吸附－洗脫－擴(kuò)增”過(guò)程篩選并富集特異性抗體。噬菌體抗體庫(kù)按抗體基因的性質(zhì)分為DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)；按抗體基因的來(lái)源分天然抗體庫(kù)、免疫抗體庫(kù)、半合成抗體庫(kù)和全合成抗體庫(kù)等。1、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本原理用PCR技術(shù)從人免疫細(xì)胞中擴(kuò)增出整套的抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因，克隆到噬菌體載體上并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面。故噬菌體DNA中有抗體基因的存在，同時(shí)在其表面又有抗體分子的表達(dá)，利用抗原-抗體特異性結(jié)合而篩選出所需要的抗體，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。

使抗體基因以分泌的方式表達(dá)，則可獲得可溶性的抗體片段。在建庫(kù)過(guò)程中如果將VH和VL隨機(jī)組合，則可建成組合抗體文庫(kù)；如果抗體mRNA來(lái)源于未經(jīng)免疫的正常人，則可以在不需要細(xì)胞融合的情況下建立起人天然抗體庫(kù)。2、構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)流程①?gòu)耐庵苎蚱ⅰ⒘馨徒Y(jié)等組織中分離B淋巴細(xì)胞，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；②應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫(kù)的需要通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的Ig基因片段；③構(gòu)建噬菌體載體。噬菌體抗體庫(kù)載體有λ噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構(gòu)建表面表達(dá)的噬菌體抗體庫(kù)(surfacedisplayantibodylibrary)常用載體；④表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫(kù)。通過(guò)多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。首先提取細(xì)胞的總RNA，經(jīng)過(guò)RT-PCR擴(kuò)增可變區(qū)基因，運(yùn)用兩種不同的限制性內(nèi)切酶分別對(duì)純化的輕鏈PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體進(jìn)行酶切，再對(duì)切割產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，按一定比例將載體和輕鏈連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒即為輕鏈庫(kù)。

再對(duì)重鏈PCR產(chǎn)物和輕鏈庫(kù)進(jìn)行雙酶切，純化后按一定比例連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，加入輔助噬菌體培養(yǎng)，離心取上清，加入聚乙二醇(PEG)沉淀并收集噬菌體顆粒，這樣就得到噬菌體總抗體庫(kù)。（1）獲取目的基因一般是提取細(xì)胞的總RNA，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）獲取抗體某一特定基因片段，如重鏈和輕鏈可變區(qū)（VH、VL）基因。抗體基因的組合形式多為單鏈抗體scFv，也用連接鏈組合成功能分子。（2）抗體庫(kù)技術(shù)的載體噬菌體抗體庫(kù)的表達(dá)載體可分為λ噬菌體、單鏈絲狀噬菌體及噬菌粒三種系統(tǒng)。噬菌粒具有噬菌體和質(zhì)粒的特點(diǎn)，噬菌粒是應(yīng)用最多的表達(dá)載體，也是簡(jiǎn)便高效模擬B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的原核表達(dá)系統(tǒng)。抗體蛋白和噬菌體外殼蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)在載體的表面，再感染后，能使目的克隆得以擴(kuò)增。琥珀終止子密碼在適當(dāng)位置上引入載體是抗體庫(kù)的關(guān)鍵性技術(shù)，而克隆位點(diǎn)后的基因序列則有利于對(duì)可溶性表達(dá)產(chǎn)物的鑒定和純化。（3）淘篩淘篩的基本過(guò)程：抗原固相化后，對(duì)噬菌粒群吸附、洗滌和脫洗后，再感染擴(kuò)增，與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級(jí)文庫(kù)，再反復(fù)與抗原吸附，經(jīng)幾輪淘篩后，淘汰了非目的克隆，使目的克隆大量的擴(kuò)增。（4）表達(dá)與鑒定目的克隆經(jīng)鑒定后，再導(dǎo)入感受態(tài)菌株，進(jìn)行可溶性表達(dá)，其產(chǎn)物用Westernblot分析確定后，完成全過(guò)程。二、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn)1、模擬天然全套抗體庫(kù)噬菌體抗體庫(kù)中，可以達(dá)到1011庫(kù)容，故能包含B細(xì)胞全部克隆，建庫(kù)的外源基因來(lái)自人體外周血淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或脾細(xì)胞中提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的DNA擴(kuò)增，這是人體多克隆細(xì)胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個(gè)人體，具有人的種屬普遍性。抗體VH和VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多變性，故能模擬天然全套抗體庫(kù)。2、避開(kāi)了人工免疫和雜交瘤技術(shù)由于抗體的大容量和極高的篩選效率，使得可以調(diào)出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能免除使用人工免疫和細(xì)胞融合技術(shù)。

3、可獲得高親和力的人源化抗體在噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)中，VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過(guò)程，所用的抗體基因又都來(lái)自人體，因此，所產(chǎn)生的抗體必然都有高親和力的人源化抗體。三、基因工程抗體的表達(dá)在篩選出陽(yáng)性克隆后，按其目的的不同，可選用不同的表達(dá)方式進(jìn)行表達(dá)。抗體分子表達(dá)使用最多的是大腸桿菌和哺乳類細(xì)胞。

1、原核細(xì)胞表達(dá)抗體表達(dá)，又分為融合表達(dá)和分泌型表達(dá)兩種。

（1）分泌型用pactac質(zhì)粒重組后在E.coli中用IPTG誘導(dǎo)下分泌到胞膜腔中。分泌型表達(dá)利于琥珀終止密碼的終止作用，在無(wú)琥珀抑制基因的菌株中進(jìn)行表達(dá)，形成的可溶性抗體就是應(yīng)用抗體。（2）融合型用pAM1控溫質(zhì)粒，30℃增殖，42℃誘導(dǎo)產(chǎn)生rhAb包含體。融合表達(dá)有利于對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行淘篩，并且有利于對(duì)克隆和抗體活性進(jìn)行鑒定。2、真核細(xì)胞表達(dá)用于表達(dá)基因工程抗體的真核細(xì)胞有酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞和真菌等，而且這些表達(dá)都是分泌型表達(dá)。3、轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)主要是煙草葉中的表達(dá)，表達(dá)的抗體稱為植物抗體。用Ti質(zhì)粒組裝后轉(zhuǎn)染的L鏈基因植株和Fd鏈基因植株有些雜交后的子代產(chǎn)生rhAb用Ti質(zhì)粒將L鏈、Fd鏈導(dǎo)入根瘤菌，再感染植物細(xì)胞，在植株體內(nèi)含有rhAb。

4、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)將人的Ig基因組轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)，讓動(dòng)物產(chǎn)生人源化抗體。目前只在單基因水平上做轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)，大的基因片段的轉(zhuǎn)移難度較大。將含F(xiàn)d和L鏈基因的重組載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞（CHO），分泌糖基化的rhAb，可達(dá)50mg/L。抗體庫(kù)的產(chǎn)生是PCR技術(shù)和基因工程抗體研究進(jìn)展的結(jié)果。可不經(jīng)過(guò)免疫，利用抗原從庫(kù)中直接篩選出特異性抗體?？贵w庫(kù)篩選抗體還具有獲得抗體時(shí)間短，可通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)、大量制備等優(yōu)點(diǎn)，特別是能直接獲得人源化抗體。故可取代單克隆抗體技術(shù)，對(duì)抗體制藥工業(yè)具有深遠(yuǎn)影響。第五節(jié)抗體診斷試劑抗原抗體特異性結(jié)合呈現(xiàn)某種反應(yīng)，在體內(nèi)和體外均可發(fā)生。在體內(nèi)，可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進(jìn)吞噬和中和毒素等作用，故抗體類藥物可用于治療。在體外，由于抗原性狀和反應(yīng)條件不同，可發(fā)生凝聚、沉淀等可見(jiàn)反應(yīng)，故可用于已知抗體鑒定抗原，做病原學(xué)診斷和血型測(cè)定，稱為血清學(xué)鑒定。隨著免疫學(xué)的發(fā)展，形成了三大類抗體診斷藥物：血清學(xué)鑒定用的抗體制劑；免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體制劑；體內(nèi)導(dǎo)向診斷藥物。其中體外實(shí)驗(yàn)用的稱為試劑，體內(nèi)導(dǎo)向診斷用的則稱為藥物。一、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑血清學(xué)鑒定是指用已知抗體來(lái)鑒定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌診斷和血型鑒定。常用的方法是凝聚反應(yīng)。特點(diǎn)是簡(jiǎn)單快速，應(yīng)用廣泛。用于病原菌診斷、癌胚抗原測(cè)定、妊娠免疫診斷、不完全血型抗體檢查等。1、鑒定病原菌的抗體試劑診斷血清既能診斷疾病，又能鑒定未知菌。（1）常用診斷血清的品種和用途診斷病原菌或相關(guān)抗原的試劑包括各種診斷血清、分群血清、分型血清、因子血清等。目前我國(guó)生產(chǎn)的主要品種如表：幾種重要的病原菌的診斷血清①沙門(mén)氏菌屬診斷血清②志賀氏菌屬診斷血清③病原性大腸埃希氏菌診斷血清⑵診斷血清的制備步驟①制備細(xì)菌抗原②免疫動(dòng)物和制備抗體血清⑶診斷血清診斷方法常用直接凝聚反應(yīng)。2、乙型肝炎病毒表面抗原的反向被動(dòng)血凝診斷試劑3、妊娠診斷試劑4、抗ABO血型系統(tǒng)血清二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑給抗體標(biāo)記放射性同位素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)方法不能觀察的反應(yīng)得以顯現(xiàn)，大幅度提高抗原抗體反應(yīng)的敏感性，用于對(duì)微量抗原物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。免疫標(biāo)記技術(shù)有三種基本類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)。1、熒光抗體診斷試劑熒光抗體是用熒光色素標(biāo)記抗體球蛋白，即成為熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細(xì)胞，熒光抗體就與抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達(dá)到診斷或定位的目的。⑴熒光抗體的制備⑵免疫熒光測(cè)定方法：直接和間接2、免疫酶抗體診斷試劑免疫酶技術(shù)是用酶標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)抗原的方法，本法分為免疫酶染色（組化法）和酶免疫測(cè)定兩種類型。（1）免疫酶染色法用抗體診斷試劑

（2）酶免疫測(cè)定用抗體診斷試劑①HBsAg酶標(biāo)診斷試劑②HBeAg酶標(biāo)診斷試劑③HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶標(biāo)診斷試劑④測(cè)定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標(biāo)抗體診斷試劑⑤甲胎蛋白（AFP）酶標(biāo)抗體診斷試劑⑥癌胚抗原（CEA）的酶標(biāo)抗體診斷試劑3、放射免疫用抗體診斷試劑放射免疫技術(shù)是將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)建立的檢測(cè)技術(shù)。特點(diǎn)：靈敏度高，特異性強(qiáng)，能測(cè)出ng/ml水平的微量物質(zhì)。（1）放射性核素標(biāo)記抗體的方法：①氯胺-T法②Iodogen氏法（2）抗原的測(cè)定方法有：①夾心法②間接法③竟?fàn)幏ǎ?）常用標(biāo)記抗體試劑有①HBsAg放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑②HBeAg放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑③HAV抗原放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑④AFP放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑⑤CEA放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑三、導(dǎo)向診斷藥物以抗體為載體的導(dǎo)向診斷藥物未在臨床廣泛應(yīng)用。放射性同位素標(biāo)記抗體的操作簡(jiǎn)便，并能觀察腫瘤的位置，故應(yīng)用廣泛。腫瘤放射免疫顯像是導(dǎo)向治療臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。放射免疫顯像優(yōu)點(diǎn)：①在體內(nèi)確切腫瘤定位作用，準(zhǔn)確性達(dá)90%，靈敏度達(dá)100%。②在體內(nèi)可檢出0.5cm大小的病灶，并可檢出肺腦的轉(zhuǎn)移灶。③小分子抗體易到達(dá)腫瘤部位，可顯著提高N（腫瘤組織）/NT（非）值。④抗體在腫瘤部位可保留6～9日⑤能觀擦抗體在血中的半衰期和可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。放射免疫顯像定位技術(shù)將抗腫瘤單克隆抗體（Ab）與二乙基三胺五乙酸（DTPA）在體外偶聯(lián)成Ab-DTPA，再注入體內(nèi)后，就能與體內(nèi)組織相結(jié)合。由于抗體分子量大，需3天完成。3天后注入放射性核素In-113M（半衰期100m），因DTPA是重金屬離子絡(luò)合劑，所以In-113M可以結(jié)合到DTPA分子上，使腫瘤組織顯像。這一過(guò)程在2小時(shí)內(nèi)可完成。建立預(yù)定位技術(shù)需解決3個(gè)問(wèn)題：①抗體在腫瘤組織滯留要7天以上。②Ab-DTPA偶聯(lián)物比較穩(wěn)定；③內(nèi)源性金屬離子對(duì)DTPA的封閉作用要小。第六節(jié)抗體治療藥物以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物，還不成熟，有的還處于臨床試驗(yàn)中。問(wèn)題（1）抗體相對(duì)分子量大，穿透力低，不能到達(dá)靶部位或其攝取量低；（2）鼠源性單克隆抗體的排斥反應(yīng)。目前正致力于抗體小型化和人源化的研究。治療性抗體發(fā)展歷程和事件（1）雜交瘤-單克隆抗體技術(shù)誕生（2）抗獨(dú)特型治療淋巴瘤成功（3）OKT3被批準(zhǔn)上市 （4）單抗用于腫瘤治療效果不佳（5）抗內(nèi)毒素單抗試用于敗血性休克失敗（6）抗17-1A和ReoPro上市（7）FDA批準(zhǔn)6個(gè)單抗上市國(guó)外有關(guān)抗體開(kāi)發(fā)的評(píng)述1998-2000年20%研制的生物藥品為單抗，正在臨床試用的治療性單抗超過(guò)上百種，到2008年7個(gè)主要市場(chǎng)用于腫瘤的治療性單抗的銷售額達(dá)44億美元，10年后市場(chǎng)上的單抗將從現(xiàn)在的11個(gè)→100個(gè)以上，預(yù)計(jì)銷售額為$500億。抗體藥物研究的主要趨勢(shì)（1）研究新的分子靶點(diǎn)（2）抗體的人源化（3）抗體藥物的高效化（4）抗體藥物分子的小型化（5）具有抗體功能的融合蛋白抗體藥物的特異性（1）與相關(guān)抗原的特異性結(jié)合（2）對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用（3）在動(dòng)物體內(nèi)的靶向性分布（4）對(duì)相關(guān)腫瘤顯示更強(qiáng)的療效（5）在臨床使用取得確定的療效抗體藥物的多樣性（1）抗原的多樣性（2）抗體結(jié)構(gòu)的多樣性（3）抗體活性的多樣性（4）免疫偶聯(lián)物與融合蛋白的多樣性抗體藥物的定向性（1）針對(duì)特定的靶分子定向制備抗體藥物（2）根據(jù)需要選擇抗體藥物的“效應(yīng)分子”一、放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，標(biāo)記操作簡(jiǎn)便用量小，同位素和抗體用量少，且能觀察到藥物在體內(nèi)的分布和藥物動(dòng)力學(xué)，應(yīng)用前景好。放射性核素標(biāo)記的抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷較大。二、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物1、常用的抗癌藥物氨基喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、絲裂霉素（MMC）等。以人血清白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTX量，使體外細(xì)胞毒性提高二倍。2、抗體類藥物逆轉(zhuǎn)耐藥性腫瘤細(xì)胞對(duì)抗原藥物可產(chǎn)生多藥耐藥性（MDR）。MDR是由基因調(diào)控的，其編碼蛋白稱為P-糖蛋白，其中P170是與腫瘤耐藥相關(guān)的主要蛋白，由MDR1基因編碼，共有1280氨基酸殘基，分子量170K。認(rèn)為P-糖蛋白是ATP酶依賴性的藥泵，藥物進(jìn)入細(xì)胞后與P-糖蛋白結(jié)合，利用ATP水解釋放的能量將藥物泵出胞外，使胞內(nèi)藥物蓄積減少，因而產(chǎn)生耐藥性。三、毒素偶聯(lián)的抗體藥物1、免疫毒素及其換代制品在導(dǎo)向藥物中，毒素和抗體的交聯(lián)物稱為免疫毒素。第一代免疫毒素是包含有A、B鏈的完整毒素和抗體的交聯(lián)物，其中B鏈非特異性結(jié)合，使這類毒素僅在體外應(yīng)用。第二代免疫毒素是抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈作用相似的單鏈核糖體失活蛋白的結(jié)合物。因避免了第一代免疫毒素的非特異性，故能在體內(nèi)有一定的抗腫瘤作用。

第三代免疫毒素-重組免疫毒素，是運(yùn)用基因重組技術(shù)對(duì)毒素加以改造去除其非特異性結(jié)合部位，降低毒性反應(yīng)，以及用基因克隆方法改造毒素基因，再和小分子抗體基因重組表達(dá)。它特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、滲透性佳、免疫原性低、可大量制備。2、免疫毒素的制備方法⑴毒素的來(lái)源制備免疫毒素的毒素主要是細(xì)菌毒素和植物毒素。⑵載體的種類載體主要是將毒素?cái)y帶至靶細(xì)胞表面，且與其結(jié)合，使毒素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部起作用，