第三章酶反應(yīng)動力學(xué)和第四章固定化酶1-4

第三章酶催化反應(yīng)動力學(xué)（2學(xué)時）主要內(nèi)容：

酶催化反應(yīng)速率與酶活的測定1底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響2酶濃度對酶促反應(yīng)速度的影響3其它因素對酶促反應(yīng)速度的影響5抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響4酶催化反應(yīng)動力學(xué)研究包括哪些內(nèi)容?重要（1）底物濃度（2）酶濃度（3）抑制劑（4）溫度（5）

pH影響因素（6）激活劑酶促反應(yīng)速度目的和意義

找到適宜的反應(yīng)條件提高或抑制酶催化反應(yīng)效率

了解酶在生理代謝過程中的作用和某些藥物的作用機(jī)制等定義：酶催化反應(yīng)動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)。1酶催化反應(yīng)速率與酶活力的測定酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可以用在一定條件下該酶所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度（reactionvelocity）來表示，酶活力的高低和化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度的大小兩者呈線性關(guān)系。1.1酶催化反應(yīng)速率隨時間的變化酶催化的反應(yīng)速度可用在單位時間內(nèi)底物的減少量或者產(chǎn)物的增加量來表示。如圖3-1所示的曲線圖。酶促反應(yīng)速度隨反應(yīng)時間延長而降低。圖3-1酶促反應(yīng)的速度曲線（1）底物濃度的降低、產(chǎn)物濃度增加從而加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行；（2）產(chǎn)物對酶的抑制作用；（3）隨著反應(yīng)時間的延長引起酶的部分失活等。引起酶促反應(yīng)速度隨反應(yīng)時間延長而降低的原因？測定反應(yīng)初速度的方法來測定相關(guān)制劑中酶的含量（活性）。如何避免影響？1.2酶活力的測定原理酶蛋白的含量很低，很難直接測定其蛋白質(zhì)的含量，且常與其他各種蛋白質(zhì)混合存在，將其提純耗時費(fèi)力。故不能直接用重量或體積等指標(biāo)來衡量。分光光度法熒光法同位素法電化學(xué)方法其他方法：如旋光法、量氣法、量熱法和層析法等測定酶活力常用的方法：測定酶活力的基本原理測定底物減少量測定產(chǎn)物增加量1.3酶活力測定時需注意：（1）選擇反應(yīng)的最適溫度，根據(jù)不同的底物和緩沖液選擇反應(yīng)的最適pH。（2）速度要快，取反應(yīng)的初速度（3）底物濃度要足夠大（一般在10Km以上）使酶被底物飽和，以充分反映待測酶的活力2底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響2.1中間絡(luò)合物學(xué)說中間絡(luò)合物學(xué)說最早是由Henri和Wurtz兩位科學(xué)家提出的。在1903年，Henri在用蔗糖酶水解蔗糖實(shí)驗(yàn)研究化學(xué)反應(yīng)中底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶濃度不變時，可以測出一系列不同底物濃度下的化學(xué)反應(yīng)速度，以該反應(yīng)速度對底物濃度作圖，可得到如圖3-2所示的曲線。

圖3-2底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Henri和Wurtz提出了酶促化學(xué)反應(yīng)的酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為：當(dāng)酶催化某一化學(xué)反應(yīng)時，酶(E)首先需要和底物(S)結(jié)合生成酶底物中間絡(luò)合物即中間復(fù)合物(ES)，然后再生成產(chǎn)物(P)，同時釋放出酶。該學(xué)說可以用下面的化學(xué)反應(yīng)方程式來表示：酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說E+Sk1k2k3ESE+P酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說酶還未被底物所飽和酶已全部被底物所飽和2.2酶促反應(yīng)的動力學(xué)方程式（米氏方程）1913年Michaelis和Menten兩位科學(xué)家在前人工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)酶促反應(yīng)的中間絡(luò)合物學(xué)說，推導(dǎo)出一個數(shù)學(xué)方程式，用來表示底物濃度與酶反應(yīng)速度之間的量化關(guān)系，通常把這個數(shù)學(xué)方程式稱為米氏方程：[S]：底物濃度V：不同[S]時的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximumvelocity)Ｋm：米氏常數(shù)(Michaelisconstant)米氏常數(shù)Km的含義Km值就代表著反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。

。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]Km＝[S]Km值的推導(dǎo)：米氏常數(shù)的應(yīng)用價(jià)值Km是酶的一個特征性常數(shù)：也就是說Km的大小只與酶本身的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。Km值還可以用于判斷酶的專一性和天然底物，Km值最小的底物往往被稱為該酶的最適底物或天然底物。Km可以作為酶和底物結(jié)合緊密程度的—個度量指標(biāo)，用來表示酶與底物結(jié)合的親和力大小。已知某個酶的Km值，就可以計(jì)算出在某一底物濃度條件下，其反應(yīng)速度相當(dāng)于Vmax的百分比。

Km值還可以幫助我們推斷具體條件下某一代謝反應(yīng)的方向和途徑，只有Km值小的酶促反應(yīng)才會在競爭中占優(yōu)勢。米氏方程的雙倒數(shù)作圖雙倒數(shù)作圖法(doublereciprocalplot)，又稱為林-貝氏(Lineweaver-Burk)作圖法Vmax[S]Km+[S]V=（林－貝氏方程）+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]兩邊同取倒數(shù)-1/Km1/[S]1/V03酶濃度對反應(yīng)速度的影響當(dāng)[S]＞＞[E]，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比關(guān)系式為：

V=K3[E]0

V

[E]

當(dāng)[S]>>[E]時，Vmax=k3[E]酶濃度對反應(yīng)速度的影響E+Sk1k2k3ESE+P4抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響區(qū)別于酶的變性抑制劑對酶有一定選擇性引起變性的因素對酶沒有選擇性酶的抑制劑(inhibitor)：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。（1）是研究酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶的催化機(jī)制以及闡明機(jī)體代謝途徑的基本手段。（2）可以為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中設(shè)計(jì)新藥物和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中設(shè)計(jì)新農(nóng)藥提供重要的理論依據(jù)。（3）在食品生產(chǎn)和保鮮中控制酶的催化效率。研究抑制劑的意義4.1抑制作用的類型及鑒別根據(jù)抑制劑與酶的作用方式的區(qū)別以及抑制作用是否可逆，我們可以將抑制作用分為兩大類，即：不可逆的抑制作用(irreversibleinhibition)可逆的抑制作用(reversibleinhibition)鑒別不可逆抑制作用抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價(jià)鍵的形式結(jié)合而引起酶活力降低或喪失。是不可逆的。本質(zhì)上來說就是酶的修飾抑制可逆抑制作用由于抑制劑與酶以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合而引起酶活力降低或喪失。是可逆的。鑒別方法（1）能否用透析、超濾和凝膠過濾等物理方法除去抑制劑？（2）化學(xué)動力學(xué)的方法（見下圖）如何鑒別？圖3-4可逆抑制劑與不可逆抑制劑的區(qū)別（一）曲線1，無抑制劑；曲線2，不可逆抑制劑；曲線3，可逆抑制劑4.2不可逆的抑制作用根據(jù)不可逆抑制劑選擇性的差異，通常把不可逆抑制劑分為兩種類型，即非專一性不可逆抑制劑和專一性不可逆抑制劑。①非專一性不可逆抑制劑有機(jī)磷化合物有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物重金屬鹽烷化劑硫化物、氰化物和CO非專一性青霉素與絲氨酸羥基共價(jià)結(jié)合與半胱氨酸的巰基共價(jià)結(jié)合使酶蛋白變性與酶多個必須基團(tuán)結(jié)合與酶中金屬離子形成穩(wěn)定絡(luò)合物機(jī)理與糖肽轉(zhuǎn)肽酶絲氨酸羥基結(jié)合舉例1：有機(jī)磷化合物對羥基酶的抑制

有機(jī)磷化合物

羥基酶解毒------解磷定(PAM)路易士氣失活的酶巰基酶失活的酶酸BAL巰基酶BAL與砷劑結(jié)合物舉例2：有機(jī)砷對巰基酶的抑制砷化合物

巰基酶解毒------二巰基丙醇(BAL)②專一性不可逆抑制劑a) Ks型不可逆抑制劑：具有與底物相類似的結(jié)構(gòu)例如：對甲苯磺酰-L-賴氨酰氯甲酮（TLCK）和胰蛋白酶的底物對甲苯硫磺-L-賴氨酰甲酯（TLME）具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)b) Kat型不可逆抑制劑：不但具有與天然底物相類似的結(jié)構(gòu)，而且抑制劑本身也是酶的底物，專一性極高，因此也被稱為自殺性底物。例如：β-鹵代-D-Ala是丙氨酸消旋酶的不可逆抑制劑4.3可逆的抑制作用根據(jù)可逆抑制劑與底物的關(guān)系，我們將可逆抑制作用分為三種類型。

競爭性抑制1非競爭性抑制2反競爭性抑制3①競爭性抑制(competitiveinhibition)：是最常見的一種可逆抑制作用。大多數(shù)競爭性抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似，能與底物競爭酶的活性中心，從而阻礙酶底物復(fù)合物的形成，使酶的活性降低。這種抑制作用稱為競爭性抑制作用。其抑制程度取決于底物和抑制劑的相對濃度，可以通過增加底物濃度的方法來解除這種抑制作用。競爭性抑制反應(yīng)模式在競爭性抑制中，底物(S)或抑制劑(I)與酶(E)的結(jié)合都是可逆的，因此存在著如下的化學(xué)平衡式：[S]>>[I]：高濃度的底物可解除抑制圖3-5競爭性抑制曲線⑴Vm值不變，(表觀）Km值增大；⑵Km隨抑制劑濃度[I]的增加而增加；⑶雙倒數(shù)作圖所得直線相交于縱軸；⑷抑制作用可以被高濃度的底物減低以致消除。特點(diǎn)：與對氨基苯甲酸競爭性抑制二氫葉酸合成酶舉例：磺胺類藥物的抑菌機(jī)制②非競爭性抑制(noncompetitiveinhibition)：非競爭性抑制劑(I)和底物(S)可以同時與酶(E)結(jié)合，兩者之間不存在競爭關(guān)系。但是在酶與抑制劑結(jié)合后，還可以進(jìn)一步與底物結(jié)合形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI；酶與底物結(jié)合后，也可以進(jìn)一步與抑制劑結(jié)合形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI。這種中間的三元復(fù)合物，即酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解產(chǎn)生產(chǎn)物，因此相應(yīng)的酶促反應(yīng)速度下降。非競爭性抑制反應(yīng)模式在非競爭性抑制中，抑制劑(I)與酶(E)或酶-底物復(fù)合物(ES)以及底物(S)與酶-抑制劑復(fù)合物(EI)的結(jié)合都是可逆的，因此存在著如下的化學(xué)平衡式：+

S－S+

S－S+ESIEIEESEP圖3-6非競爭性抑制曲線⑴Vm值降低，Km值不變；Vm隨[I]的增加而降低；⑵雙倒數(shù)作圖所得直線相交于橫軸；⑶抑制劑對酶與底物的結(jié)合無影響，故底物濃度的改變對抑制程度無影響；抑制程度取決于抑制劑的濃度。特點(diǎn)：這類抑制最典型的例子是亮氨酸是精氨酸酶的一種非競爭性抑制劑。有某些重金屬離子如Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等對酶的抑制作用也屬于這一類。EDTA對金屬酶的抑制。舉例：③反競爭性抑制(uncompetitiveinhibition)：這類抑制作用的特點(diǎn)是只有在酶(E)與底物(S)結(jié)合后，才能與抑制劑(I)結(jié)合，形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI，與非競爭性抑制相似，這種中間的三元復(fù)合物，即酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解產(chǎn)生產(chǎn)物，因此相應(yīng)的酶促反應(yīng)速度下降。反競爭性抑制反應(yīng)模式反競爭性抑制的特點(diǎn)是，酶(E)必須先與底物(S)結(jié)合，然后才與抑制劑(I)結(jié)合，即抑制劑(I)與酶-底物復(fù)合物(ES)的結(jié)合是可逆的，因此存在著如下的化學(xué)平衡式：++ESESESIEP圖3-7反競爭性抑制曲線⑴Vm值和Km值都隨[I]的增加而降低；⑵雙倒數(shù)作圖所得為一組平行線；⑶必須有底物存在，抑制劑才能對酶產(chǎn)生抑制作用；抑制程度隨底物濃度的增加而增加。特點(diǎn)：舉例：這種抑制作用在單底物反應(yīng)中比較少見，而常見于多底物反應(yīng)中。目前已經(jīng)證明，肼類化合物對胃蛋白酶的抑制作用、氰化物對芳香硫酸酯酶的抑制作用、L-Phe和L-同型精氨酸等多種氨基酸對堿性磷酸酶的抑制作用都屬于反競爭性抑制。為了方便理解和記憶，我們現(xiàn)將無抑制劑和有抑制劑等不同情況下的米氏方程和Vmax及Km的變化總結(jié)歸納在表3-1中?？偨Y(jié)：5其它因素對酶促反應(yīng)速度的影響其它各種影響酶促反應(yīng)速度的因素主要包括：溫度、pH和激活劑等。5.1溫度對酶促反應(yīng)速度的影響溫度對酶促反應(yīng)的雙重影響：一、當(dāng)溫度升高時，與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，反應(yīng)速度加快（Q10一般等于2）。二、溫度升高隨著溫度逐漸升高，酶蛋白會因逐漸變性而失活）。圖3-9溫度對酶促反應(yīng)速度的影響酶在固體狀態(tài)下比在溶液中對溫度的耐受力更高。酶的冰凍干粉制劑通常在冰箱中可存放幾個月以上，而酶溶液一般在冰箱中只能保存數(shù)周。所以酶制劑以固體保存為佳。一般來說，動物細(xì)胞內(nèi)的酶最適溫度一般為35～40℃，植物細(xì)胞中的酶最適溫度較動物細(xì)胞中稍高，通常在40～50℃之間，而微生物中的酶最適溫度差別則較大，如用于進(jìn)行PCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶的最適溫度可高達(dá)70℃。5.2pH對酶促反應(yīng)速度的影響通常在一定pH下，酶會表現(xiàn)出最大活力，而一旦高于或低于此pH，酶活力就會降低，我們把表現(xiàn)出酶最大活力時的pH稱為該酶的最適pH。在不同pH條件下進(jìn)行某種酶促化學(xué)反應(yīng)，然后將所測得的酶促反應(yīng)速度相對于pH來作圖，即可得到如圖3-10所示的鐘罩形曲線。圖3-10pH對酶活力的影響pH影響酶活力的原因可能包括以下3個方面：(1)過酸或過堿使酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起酶變性從而導(dǎo)致酶構(gòu)象的改變、酶活性隨之喪失。(2)pH影響了底物的解離狀態(tài)或酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)或酶-底物復(fù)合物的解離狀態(tài)，而使底物不能與酶結(jié)合形成酶-底物復(fù)合物，或者形成酶-底物復(fù)合物后不能生成產(chǎn)物，使酶活性降低。(3)pH影響了與維持酶分子空間結(jié)構(gòu)有關(guān)的基團(tuán)解離，從而改變酶活性部位的構(gòu)象，進(jìn)而降低了酶的活性。與酶促化學(xué)反應(yīng)的最適溫度不同的是，各種酶在一定條件下都有其特定的最適pH，因此最適pH是酶的特性之一。但是酶的最適pH并不是一個常數(shù)，它受諸如底物種類和濃度、緩沖液種類和濃度等眾多因素的影響，因此只有在一定條件下最適pH才有意義。4種pH-酶活性曲線絕大多數(shù)酶的最適pH在5～8之間，動物體內(nèi)的酶最適pH多在6.5～8.0之間，植物及微生物中的酶酶最適pH多在4.5～6.5左右。但并不排除例外，如胃蛋白酶的最適pH為1.5，肝中精氨酸酶最適pH為9.7等等。5.3激活劑對酶促反應(yīng)速度的影響與抑制劑相對的是，凡是能提高酶活性的物質(zhì)都稱為激活劑(activator)，而激活劑中大部分是無機(jī)離子或簡單的有機(jī)化合物。無機(jī)離子

K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+及Fe2+

Cl-、Br-、I-、CN-、PO4-有機(jī)化合物EDTA可解除金屬對酶的抑制半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、抗壞血酸對某些含巰基的酶有激活作用，保護(hù)酶分子中的巰基不被氧化激酶唾液淀粉酶一種激活劑只對某種酶起激活作用，而對另一種酶可能不起任何作用或起抑制作用。如對脫羧酶而言有激活作用的Mg2+對肌球蛋白腺三磷酶卻有抑制作用；而對脫羧酶而言有抑制作用的Ca2+對肌球蛋白腺三磷酶卻有激活作用。有時各種離子之間有拮抗作用如被K+激活的酶會受Na+的抑制，被Mg2+激活的酶會受Ca2+的抑制。有時金屬離子的作用也可以相互替代如作為激酶的激活劑的Mg2+可被Mn2+所代替。激活劑的選擇性第四章固定化酶和固定化細(xì)胞（2學(xué)時）主要內(nèi)容：1固定化酶的定義與優(yōu)點(diǎn)2酶固定化技術(shù)發(fā)展史3固定化酶的制備方法4固定化酶的特性5固定化活細(xì)胞6酶催化反應(yīng)器及其類型游離酶的使用蒸汽→酶解罐簡易圖加熱滅酶酶無法回收穩(wěn)定性差1固定化酶的定義與優(yōu)點(diǎn)所謂固定化酶(immobilizedenzyme)，是指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復(fù)和連續(xù)使用的酶。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：（1）同一批固定化酶能在工藝流程中重復(fù)多次地使用；（2）固定化后，和反應(yīng)物分開，有利于控制生產(chǎn)過程，同時也省去了熱處理使酶失活的步驟；（3）穩(wěn)定性顯著提高；（4）可長期使用，并可預(yù)測衰變的速度；（5）提供了研究酶動力學(xué)的良好模型。2酶固定化技術(shù)發(fā)展史

起始研究1916年系統(tǒng)研究1950年-工業(yè)化應(yīng)用1969年-1916年，Nelson和Griffin將蔗糖酶吸附在骨炭粉上，吸附以后酶不溶于水且具有和液體酶同樣的活性，實(shí)現(xiàn)了酶的固定化，可惜長期未得到重視。1953年Grubhofer和Schleith將聚氨基苯乙烯樹脂重氮化，然后將淀粉酶等與這種載體結(jié)合，制成了固定化酶。60年代后期，酶固定化技術(shù)迅速發(fā)展，出現(xiàn)了很多新的酶固定化方法。1969年，千畑一郎等將固定化氨基?；笐?yīng)用于DL-氨基酸的光學(xué)拆分上，來生產(chǎn)L-氨基酸，開創(chuàng)了固定化酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的先例。1973年，將固定化微生物細(xì)胞首次應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。目前，固定化技術(shù)已經(jīng)取得了許多重要成果，充分發(fā)揮了固