第7章 現(xiàn)代生物技術(一)

人工基因組的設計與合成李炳志bzli@2013-041第七章

現(xiàn)代生物技術(一)李炳志bzli@2013-042第七章

現(xiàn)代生物技術(一)DNA重組技術聚合酶鏈式反應3DNA重組DNA重組是指由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產生的DNA片段的交換和重新組合，形成新的DNA分子的過程。自然DNA重組DNA重組人工DNA重組4復制翻譯轉錄不同來源的DNA分子重組DNA分子5自然DNA重組：指細胞基因組中DNA順序重新排列組合的現(xiàn)象。人工DNA重組：指在體外用人工（酶學）的方法將目的基因與載體DNA重組，并把重組體DNA導入宿主細胞，使目的基因擴增和表達的技術。6自然基因重組的方式

1．接合:指供體細胞（細菌）和受體細胞（細菌）

接觸，使DNA從一個細胞轉移到另一個細胞的過程。.例:較大質粒在細菌間的轉移2．轉化：指外源DNA被引入細胞，導致其遺傳和生物性狀改變的過程。例：細菌抗藥性3．轉導：以病毒為媒介、將供體菌的DNA片段轉移到受體菌基因組的過程。

例：噬菌體感染宿主菌

74．轉座：指可移動的DNA序列（游動基因）從基因組的一處移動到另一處的過程。a.插入序列：轉座酶基因＋反向重復序列b.轉座子定義：可從染色體一個位點轉移到另一位點的分散的重復序列。8DNA重組的類型1、同源重組（HomologousRecombination）2、位點特異性重組（Site-specificRecombination）3、DNA的轉座（transposition）9同源重組

1、定義：兩個DNA分子同源序列之間進行的重組2、條件：（1）兩個DNA分子有同源序列（相關的酶可以用任何一對同源序列為底物）（2）兩個DNA分子必須緊密接觸3、發(fā)生：真核生物:非姐妹染色單體交換相對應的區(qū)域。原核生物:依賴recA蛋白，并形成Holliday 結構10斷裂和重連產生異源雙鏈DNA1.同源序列排列在一起；2.酶切。通過核酸酶和RecBCD蛋白復合體的作用在一對同源DNA上產生切口；3.入侵。含有3’端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA細絲；RecA-ssDNA細絲尋找相對的DNA雙螺旋上的相應序列。細菌同源重組的機制---Holiday重組模型114.游離端交叉連接，形成Holliday

結構5.通過分支遷移產生異源雙鏈DNA。十字形結構126.空間重排。十字型兩臂旋轉180度7.解離(兩種不同方式)8.修補連接13位點特異性重組一、定義：不依賴于DNA順序的同源性，而依賴于能與某些酶相結合的特異的DNA序列的存在。例子：噬菌體λ對E.coliDNA的整合

（一）λDNA存在兩種形式裂解狀態(tài)溶源狀態(tài)（二）通過位點特異性重組實現(xiàn)兩種類型間的轉換

λDNA整合到宿主DNA進入溶源狀態(tài)

λDNA從宿主DNA中切離進入裂解狀態(tài)14（三）催化重組的酶

1、整合酶Int(integrase)：有拓撲異構酶活性

2、整合宿主因子（IHF，integrationhostfactor）

3、切除酶（excisionase）/終止重組（四）重組位點：附著位點（attachmentsite）

attP（POP’）和attB（BOB’）有15bp核心序列配對（五）重組過程：

1、整合：POP’+BOB’→BOP’—POB2、切離：BOP’—POB’→POP’+BOB’15λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖）16attPattB17DNA的轉座一、轉座子（transposon）的定義：

存在于染色體DNA上可自主轉移座位的基本單位

二、轉座子發(fā)現(xiàn)：

McClintockB：1938年，提出轉座基因概念

1983年，獲諾貝爾生理醫(yī)學獎

J.Shapiro等：1980年，證實了可移位的遺傳基因存在18DNA的轉座復制型轉座：整個轉座子被復制，所移動和轉位的僅僅是原轉座子的拷貝。19DNA的轉座非復制型轉座：轉座子作為一個可移動的單位直接被移位，留下一個供體位點（通常產生一個雙鏈斷裂的缺口）。20人工DNA重組技術克隆（clone）：指由同一個始祖經過無性繁殖所形成的副本或拷貝集合。克隆化：獲得同一拷貝的過程。基本要素酶目的基因載體基因宿主21DNA重組技術酶切連接轉化擴增檢測目的基因的獲取克隆載體的構建外源基因與載體的連接（體外重組）重組DNA導入受體菌轉化子的篩選和鑒定克隆基因的表達22重要的工具酶工具酶

基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、逆轉錄等相關的各種酶類。23限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)

是一類由細菌產生的能專一識別和切割雙鏈DNA中的特定堿基序列的核酸內切酶，簡稱限制酶或切割酶。

根據限制酶作用特性，一般分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。

24

限制酶（Ⅱ型）識別及切割位點特異識別及切割48個bp長度且具有回文序列的DNA片斷，主要產生3種末端結構：5ˊ－粘性末端

3ˊ－粘性末端平端或鈍端

回文序列(palindrome)

是指該部位的核苷酸序列呈180O反向重復;

粘性末端(stickyend)

是指經內切酶特異切割后產生的5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出的堿基序列相互間具有互補性。25⑴產生5'-粘性末端

⑵產生3'-粘性末端26⑶產生平(頭末)端/鈍端其它特殊性質的Ⅱ型限制酶同裂酶（異源同工酶）同尾酶可變酶27同裂酶

又稱異源同工酶。指來源不同，但具有相同的識別序列。在切割DNA時，其切割點可以是相同的，產生平頭末端，稱為同識同切；

切割點也可以是不同的，產生3ˊ或5ˊ粘性末端，稱為同識異切。28同裂酶——同識同切29同裂酶——同識異切30

同尾酶

指來源不同，但識別與切割順序有一定的相關性的一類酶。它們作用后產生相同的粘性末端。31可變酶識別順序中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別順序往往超過6個堿基對。如，BstpⅠ，其識別順序為GGTNACC。32

常用限制性核酸內切酶的特性微生物名稱酶名稱識別順序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢桿菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢桿菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大腸桿菌