分子生物學 05-分子生物學研究法

分子生物學研究法一.重組DNA技術(shù)概論二.常見的DNA操作技術(shù)三.基因克隆技術(shù)(狹義)四.基因表達研究技術(shù)五.基因芯片及數(shù)據(jù)分析六.蛋白質(zhì)組學及其研究技術(shù)一.重組DNA技術(shù)概論二.常見的DNA操作技術(shù)2.1瓊脂糖凝膠電泳2.2SDS電泳2.3PCR技術(shù)2.4測序技術(shù)2.5雜交技術(shù)2.6ELISA技術(shù)2.7細菌轉(zhuǎn)化2.8cDNA文庫2.9SNP技術(shù)及應用2.10基因打靶瓊脂糖凝膠電泳1、原理：2、用途：3、技術(shù)要點瓊脂糖凝膠電泳的原理

1.DNA電泳遷移：電荷效應＋分子篩效益（1）DNA帶負電，電場中，向正極移動；（2）決定移動速度三因素：DNA大小，電荷數(shù)，構(gòu)型；

(3)線性DNA分子移動速度與其分子質(zhì)量的對數(shù)成反比；（分子量越大，跑得越慢）

2、檢測原理：（1）溴化乙錠（EB）可插入雙鏈DNA分子中，在紫外光照射下，發(fā)射熒光。瓊脂糖凝膠電泳用途1.DNA分子量測定（距離－>分子量）2.基因，克隆的鑒定（通過1完成）3、不同長度的基因片斷的分離4、DNA濃度的測定

（熒光的強度與DNA含量成正比）*也可用于蛋白的分離鑒定加標準分子量DNAMarker,測定分子量加標準濃度的DNA，測定濃度瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)要點1.不同濃度凝膠分辨DNA片段能力不一樣(p33)(1)低:不利于小片段的分辨(擴散)(2)高:不利于大片段的分辨(遷移不動)(3)一般選1.0%2.凝膠要用緩沖液配(TBE或TAE)3.EB強致癌，帶手套操作；4.agarose(瓊脂糖）－－－電泳

agar(含瓊脂糖和瓊脂膠）－－－平板培養(yǎng)基SDS電泳1、原理2、用途3、技術(shù)要點SDS電泳原理1.SDS(帶負電)和還原劑破壞蛋白的高級結(jié)構(gòu),同時SDS與蛋白定量結(jié)合,消除蛋白之間的電荷差異,使得蛋白的遷移率主要依賴分子量(分子小跑得快).2.不連續(xù)電泳:上層為濃縮膠,可將樣品壓縮到同一起跑線,下層為分離膠;可獲得更高的分辨率.3.考馬斯亮藍進行染色.SDS電泳用途1.蛋白分子量的測定2.蛋白濃度的測定3.蛋白的鑒定(通過1來實現(xiàn))SDS技術(shù)要點1.濃縮膠一般用5%,

分離膠:次高分子(10萬-20萬)用7%,

低分子(1.4萬－10萬）用12％2、PAGE配制時帶手套，（Acr-Bis液體有積累性神經(jīng)毒，聚合后無毒)3.SDS－PAGE測定的是單體蛋白分子量；（多亞基不行）4、SDS－PAGE不適于：（1）電荷異常蛋白：組蛋白（＋電多）（2）構(gòu)象異常的蛋白（3）帶有較大輔基的蛋白－－糖蛋白，脂蛋白。PCR技術(shù)1、原理2、應用3、技術(shù)要點PCR技術(shù)原理循環(huán)過程(32次左右）1.解鏈：94℃,30s2.引物結(jié)合:？

℃，30s3.延伸：72℃，？Min

特點1.引物兩條，以2n指數(shù)擴增（前20-25次），后面擴增效率降低，30次以后，基本進入平臺期。2.引物結(jié)合溫度？

℃一般為50-55℃，需要調(diào)整；3.延伸時間？Min需要調(diào)整，一般1kb/min.PCR技術(shù)應用1.基因檢測；2.基因的制備（包括基因的修飾）PCR技術(shù)操作要點1.靈敏度高，防止污染，出現(xiàn)假陽性(帶手套，設(shè)立陰性，陽性對照）；2.需要摸索結(jié)合溫度，提高擴增的特異性。雜交技術(shù)1.Southernblot檢測DNA2.Northernblot檢測RNA3.Westernblot檢測蛋白Southernblot,Northernblot和Westernblot比較名稱檢測對象探針檢測原理處理過程用途SouthernblotDNA標記單鏈核酸核酸復性中堿基配對專一性瓊脂糖電泳后轉(zhuǎn)膜基因檢測（拷貝數(shù)）NorthernblotRNA標記單鏈核酸核酸復性中堿基配對專一性變性瓊脂糖電泳后轉(zhuǎn)膜基因表達的檢測（表達量）Westernblot蛋白抗體抗原－抗體特異性結(jié)合SDS后轉(zhuǎn)膜基因表達產(chǎn)物――蛋白的檢測ELISA原理和用途類似于Westernblot,但在酶標板中操作，無需SDS轉(zhuǎn)膜，操作簡單，可批量檢測，并可半定量測定。SouthernblotNorthernblotWesternblot雙脫氧法測序

(Dudeoxysequenceanalyses)雙脫氧法又稱末端終止法，用于單鏈測序1.原理：

Atkinson發(fā)現(xiàn)用DNApol合成DNA時如在反應物中加入一定量的2`,3`ddTTP時，因ddT

的3`碳原子不含－OH,故DNA不能延伸。1982年Sanger利用此原理建立了雙脫氧測序法。原理和加減法相似，但不再是加一種dNTP或減一種dNTP,而是加入某一種雙脫氧核苷，來終止聚合反應。用此法測得G4含5577bp.2.1細菌轉(zhuǎn)化通常情況下，外源基因無法進入細菌細胞內(nèi)；當用電擊法，或CaCl2，或RuCl等方法處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源基因進入的感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞的活性較低，處理需溫柔。2.2PCR(聚合酶鏈式反應)技術(shù)PCR的基本原理變性、復性、半保留復制

PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃PCR2.3cDNA文庫cDNA:

(1)將mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA.

(2)特點:

A.穩(wěn)定;

B.無內(nèi)含子.二.cDNA文庫:

(1)

代表了生物體某一器官或者組織mRNA中所含的全部或絕大部分遺傳信息.(2)特點:

A.不同的生物,同一生物不同組織,同一組織不同發(fā)育時間或不同生理狀態(tài)下,cDNA文庫不同;B.建好的cDNA文庫的具體的信息未知,僅提供吊取相關(guān)目的基因的材料.C.每個克隆不一定是全長基因cDNA文庫建庫過程1.高質(zhì)量mRNA的制備;2.反轉(zhuǎn)錄生成cDNA3.與載體分子連接(噬菌體文庫)4.轉(zhuǎn)染(噬菌體的包裝)說明:引物oligodT,隨機引物R6(得到全長cDNA)兩端可加上酶切接頭,便于克隆到載體上.合成時,原料用甲基化的dCTP.防止酶切時損傷內(nèi)部序列.轉(zhuǎn)化效率要高,防止少量表達的mRNA未得到克隆.2.4SNP技術(shù)及應用Singlenucleotidepolymorphism單核苷酸多態(tài)性(標記)是指同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的變化，主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性。用途:(1)遺傳的分子標記物種鑒定

(2)生物功能異常的基因標記疾病的檢測;SinglenucleotidepolymorphismSNP的特征SNP是人類可遺傳的變異中最常出現(xiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，在人類基因組中廣泛存在，大約平均1000個堿基對就會出現(xiàn)一個SNP，估計整個人類基因組30億堿基中至少有300萬個SNP。

SNP大都表現(xiàn)為二等位基因（bialletic)多態(tài)性,即在該位置只存在兩種不同的堿基。SNP作為一種堿基的替換，大多數(shù)為轉(zhuǎn)換（C—T，G—A），也可能是顛換。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，而且在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，多是發(fā)生C—T的轉(zhuǎn)換，原因是CG中的C是甲基化的，它能自發(fā)的脫氨基而替換為胸腺嘧啶。SNP的檢測方法單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)

原理：單鏈DNA的折疊結(jié)構(gòu)是由單核苷酸序列決定的，當某一個堿基發(fā)生突變時，便會直接影響該鏈的構(gòu)象，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移率會發(fā)生改變。變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)

原理:當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性溫度一致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同的時間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。熒光共振能量傳遞

(fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)

供者受者

探針5‘3‘Taqman法分子信標(molecularbeacon)法

高效液相色譜ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質(zhì)譜分析法DNA芯片技術(shù)（DNAchip）

SNP數(shù)據(jù)庫美國國立生物技術(shù)信息中心/snp德國的HGBAS網(wǎng)站

http://www.hgbas.cgr.ki.sei日本JST的數(shù)據(jù)庫

http://snp.ims.u-tolkyo.ac.jp2.5基因打靶(genetargeting)通過DNA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究該基因的功能。(反向遺傳學)基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代基因打靶的必備條件胚胎干細胞(ES細胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性打靶載體Neo（新霉素）陽性篩選標志HSV-tk陰性篩選標志：單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)基因敲除的基本程序打靶載體的構(gòu)建打靶載體導入ES細胞：重組置換基因敲除ES細胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種基因敲除Knockout1.完全基因敲除可能會致死.2.條件型基因敲除Cre/LoxP,FLP/FRT基因敲除的缺點能將基因與表型(生物功能)聯(lián)系起來,但不能提供具體的作用機制;對多基因決定的表型無法將其聯(lián)系全部找出;操作復雜,成本高.三.基因克隆技術(shù)(狹義)

獲取目的基因的技術(shù)1.RACE技術(shù)2.cDNA差示顯示法3.基因大規(guī)?？寺〖夹g(shù)4.酵母雙雜交法5.酵母單雜交系統(tǒng)6.基因的圖位克隆法3.1RACE技術(shù)RapidamplificationofcDNAends已知基因一端序列,快速獲取另一端序列.5’RACE(獲取5’序列)3’RACE(獲取3’序列)需要合成引物接頭(單鏈DNA),用RNAligase將基因(RNA)與引物(DNA)連接.5’RACE3’RACE(非mRNA擴增)合成兩條互補的引物,序列任意.及一條序列特異的引物互補引物中一條5’標記Pi,通過RNAligase將其與RNA連接.3.2cDNA差示顯示法(cDNA-RDA)僅知道生理功能,性狀,對基因序列一無所知.獲得該相關(guān)基因的方法.原理:A.樣本(sample)與對照(control)mRNAs被轉(zhuǎn)錄成cDNA,酶切加可PCR擴增接頭,擴增后除去接頭,只有樣本被加上新接頭(可PCR擴增).B.樣本(ss)與過量對照(cc)雜交后,PCR擴增.sc被線形擴增;ss被指數(shù)擴增;CC不被擴增.3.3基因大規(guī)?？寺〖夹g(shù)(Gateway克隆技術(shù))1.不需要酶切,連接;2.利用TOPO反應,將PCR產(chǎn)物克隆到Entry載體;再通過LR反應,將基因定點,定向重組到表達載體.3.上游引物5’端需要引入CACC序列.3.4酵母雙雜交法

（蛋白－蛋白相互作用）1.篩選與已知蛋白相互作用的蛋白基因2.真核生物的轉(zhuǎn)錄激活子基本結(jié)構(gòu)一般有2個功能域（functionaldomain）DNA結(jié)合域（DNA-bindingdomain）－－DBD轉(zhuǎn)錄激活域（transcription-activatingdomain）--AD(許多激活子還有二聚體化域,有的還有受體結(jié)合域)“獵物”為一個庫；２．將不同的“誘餌”克隆后，捕獲不同的“獵物”３.5酵母單雜交

（蛋白核酸相互作用）用于鑒定與特定順式作用元件（DNA序列）作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合域．或反之．３.6基因的圖位克隆法

目的：克隆具有某種表型的未知基因的方法．原理：略四.基因表達研究技術(shù)１.基因表達系列分析技術(shù)（SAGE)2.RNA選擇性剪切機制3.原位雜交技術(shù)４.定點突變技術(shù)５．RNAi技術(shù)4.１.基因表達系列分析技術(shù)（SAGE)

以測序為基礎(chǔ)的定量分析全基因組表達模式的技術(shù)，能夠直接讀出任何一種類型細胞或組織的基因表達信息；理