第四講 微生物與生物轉(zhuǎn)化

4.微生物與生物轉(zhuǎn)化概述生物催化劑：微生物（細(xì)胞直接進(jìn)行催化）酶的來(lái)源，催化非天然有機(jī)物發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：1、同時(shí)參與反應(yīng)的酶的種類多——底物范圍廣

2、不需要進(jìn)行酶的分離純化——方便，廉價(jià)，高效

3、解決輔酶再生問(wèn)題缺點(diǎn)：1、副產(chǎn)物多——得率低

2、產(chǎn)物分離純化困難用途：有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸、抗生素、維生素、甾體激素等手性化合物的工業(yè)化生產(chǎn)4.1微生物學(xué)基礎(chǔ)微生物的特點(diǎn)微生物（microorganism）：

所有形態(tài)微小，單細(xì)胞的或個(gè)體結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的多細(xì)胞的、甚或沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物的通稱。

微生物類群十分龐雜，包括：病毒(不具細(xì)胞結(jié)構(gòu))、立克次氏體、細(xì)菌、放線菌(單細(xì)胞)

酵母、霉菌、單細(xì)胞藻類、原生動(dòng)物等

原核生物：不具核膜，核物質(zhì)裸露，沒(méi)有有絲分裂過(guò)程真核生物：細(xì)胞核有核膜，進(jìn)行有絲分裂特點(diǎn)

1、體積小，面積大——比表面積大，代謝強(qiáng)度大

2、種類多——10萬(wàn)種以上，各具特性(三廢處理、合成產(chǎn)品)

3、分布廣——營(yíng)養(yǎng)要求不高，生長(zhǎng)繁殖速度快，土壤

4、繁殖快，轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)

5、適應(yīng)性強(qiáng)，容易培養(yǎng)——誘導(dǎo)酶、抗逆性強(qiáng)、極端微生物溫度、壓力、高鹽濃度、酸堿、干燥、輻射、毒物等

和化學(xué)合成法相比：常溫常壓、原料廉價(jià)、來(lái)源廣、不需其他特殊催化劑、環(huán)境友好

6、易變異：本質(zhì)是基因突變，優(yōu)點(diǎn)，也是缺點(diǎn)——可調(diào)常用微生物：細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌

1、細(xì)菌：球狀、桿狀、螺旋狀，分裂生殖，體積很小球菌：球形或橢圓形。分裂后產(chǎn)生的新細(xì)胞常保持一定的空間排列方式。（單球菌、葡萄球菌等）桿菌：桿狀或圓柱形。發(fā)酵工業(yè)中最常用。螺旋菌：細(xì)胞呈彎曲桿狀。（弧菌、螺旋菌）醋桿菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、大腸桿菌、短桿菌屬

2、放線菌菌落呈放線狀而得名（Actinomyces）厭氣菌——放線菌屬好氣菌——鏈霉菌屬，也是放線菌放線菌多為腐生，少數(shù)寄生。菌落特點(diǎn)：干燥，不透明，表面呈緊密的絲絨狀，上面有一層色彩鮮艷的干粉；菌落和培養(yǎng)基

連接緊密，那以挑?。痪湔疵骖伾３２灰恢伦钔怀龅奶匦裕寒a(chǎn)生大量的、種類繁多的抗生素

目前已發(fā)現(xiàn)和分離的5500種以上的抗生素，其中4400多種為放線菌所產(chǎn)生。實(shí)際應(yīng)用的有100多種，如鏈霉素、井岡霉素等。此外，還可用于：

生產(chǎn)維生素、嵋制劑；甾體轉(zhuǎn)化、石油脫蠟、烴類發(fā)酵、污水處放線菌的存在范圍：土壤中最多，河流、湖泊和海洋中較少；大氣中也有很多菌絲和孢子，食品、動(dòng)物上

放線菌為單細(xì)胞，革蘭氏陽(yáng)性。菌絲分為：營(yíng)養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲

放線菌孢子較耐干燥，不耐高溫（65度15分鐘）放線菌的代表屬：鏈霉菌屬諾卡氏菌屬：可用于污水處理等放線菌屬：多為致病菌小單胞菌屬鏈孢囊菌屬：可形成孢子囊和孢囊孢子游動(dòng)放線菌屬：孢囊孢子可以運(yùn)動(dòng)3、霉菌（mold）是一類“絲狀真菌”的通稱，不是分類學(xué)上的名詞，在分類學(xué)上分別隸屬于藻狀菌、子囊菌和半知菌。定義：凡在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上生長(zhǎng)形成絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀或絮狀菌絲體的真菌，通稱為霉菌。霉菌的菌落特征和放線菌類似，但是菌落較大，質(zhì)地一般比放線菌疏松。用途：釀酒、制醬、發(fā)酵工業(yè)、農(nóng)業(yè)、紡織、食品、皮革加工但是也會(huì)引起發(fā)霉變質(zhì)，是人和動(dòng)植物致病。

全世界由于霉變而不能食（飼）用的谷物約占2％。目前已知的霉菌毒素達(dá)100種以上。其中毒性最強(qiáng)的是由黃曲霉菌產(chǎn)生的黃曲霉毒素——致癌常用霉菌：a.毛酶：制作腐乳、豆豉等食品，甾體轉(zhuǎn)化b.根霉：淀粉酶、糖化酶（米根霉）c.曲霉：制醬、釀酒、制醋、酶制劑、有機(jī)酸、糖化黑曲霉、米曲霉、黃曲霉d.青霉：產(chǎn)黃青霉、橘青霉、婁地青霉、展青霉e.紅曲、木霉、地霉、假囊霉、脈孢菌、交鏈孢霉、

赤霉菌、白僵菌（生物農(nóng)藥，昆蟲病害的防治）4、酵母（Yeast）大多數(shù)酵母為單細(xì)胞。一般呈卵圓形、圓形、圓柱形或者檸檬形。常用的為：酵母屬（Saccharomyces）和假絲酵母（Candida）。主要有釀酒酵母、產(chǎn)阮假絲酵母、

熱帶假絲酵母、畢赤酵母等。微生物菌種的分離1、采樣：地點(diǎn)的確定：篩選目的、微生物分別特征、菌種的特征一般在土壤中。（有的放矢）取樣范圍要廣2、增殖培養(yǎng)：一般需要進(jìn)行目的菌種的富集選擇有利于目的菌種生長(zhǎng)繁殖而非目的菌種不容易生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)條件。如特殊底物、溫度、pH、微量元素、金屬離子、抑制劑等。4.2微生物的分離和選育3、純種分離增殖培養(yǎng)后——各種菌種的混合物發(fā)酵或者培養(yǎng)要求——純種方法：a.劃線法b.稀釋法目的：獲得單菌落過(guò)程中也可以加入篩選控制條件，提高篩選效率4、性能鑒定兩步法：初篩（快速的培養(yǎng)和測(cè)定方法，也可在純種分離時(shí)進(jìn)行）復(fù)篩（比較復(fù)雜，精確，定量，可以確定目的菌種）重復(fù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)菌種性質(zhì)，獲得幾株野生型菌株誘變育種野生型菌種性能尚達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此要進(jìn)行“育種：。方法：基因突變（自然、誘發(fā)）

誘變：誘變劑處理（致死率和突變率，正突變和負(fù)突變）、高效篩選方法：可以借鑒野生型的篩選方法存在主要問(wèn)題：工作量大、缺乏人工控制、提高幅度有一定限度（尤其對(duì)于高產(chǎn)突變菌種）工作程序：a.選擇出發(fā)菌株（連續(xù)誘變）

b.菌懸液的制備（單細(xì)胞或者孢子進(jìn)行誘變）

c.誘變：化學(xué)誘變、物理誘變

物理誘變劑：各種射線，最常用的紫外線，太空育種對(duì)DNA發(fā)生作用化學(xué)誘變劑：作用原理比較復(fù)雜，常用的如亞硝基胍和甲基磺酸乙酯（EMS）

d.變異株的分離和篩選初篩：菌落形態(tài)、色澤的變化（有時(shí)會(huì)和性質(zhì)有關(guān)聯(lián)）指示平板：平板培養(yǎng)基中有指示劑復(fù)篩：營(yíng)養(yǎng)缺陷型（中間培養(yǎng)淘汰野生型）缺陷的類型：氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶等發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢查其生產(chǎn)性能重組工程菌的構(gòu)建天然微生物中所需要的酶含量少，不能適應(yīng)生物催化的要求利用遺傳工程技術(shù)可以構(gòu)建新的工程菌大量表達(dá)生物催化所需要的酶滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要操作步驟：

a.載體b.基因的分離c.DNA分子的切割和連接

d.引入宿主細(xì)胞e.重組體的篩選f.外源基因的表達(dá)（轉(zhuǎn)錄、翻譯、修飾）原生質(zhì)體技術(shù)：多酶體系的重組包括：原生質(zhì)體誘變、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染、融合等。

克隆天然酶基因已知序列直接用PCR擴(kuò)增未知序列根據(jù)同類酶保守序列設(shè)計(jì)引物或探針釣基因建立genomicDNA或cDNA表達(dá)文庫(kù)篩選純化酶，測(cè)定部分序列，設(shè)計(jì)引物或探針釣基因表達(dá)系統(tǒng)的共性基因克隆至表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主細(xì)胞篩選轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)表達(dá)蛋白質(zhì)重組酶表達(dá)小結(jié)選用強(qiáng)啟動(dòng)子若需翻譯后修飾選用酵母系統(tǒng)蛋白質(zhì)折疊和降解是高表達(dá)方案中的主要問(wèn)題融合表達(dá)蛋白酶缺陷菌株發(fā)酵條件

培養(yǎng)基：微生物的生長(zhǎng)、繁殖、產(chǎn)物形成、產(chǎn)品提取分離

工藝的選擇

a.提供構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的有關(guān)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

b.提供能量

c.加入前體物質(zhì)用于提高產(chǎn)品的產(chǎn)量包括：碳源（糖類、有機(jī)酸、醇和氨基酸、碳?xì)浠衔铩⒍趸迹夂献饔?，化學(xué)能）氮源：有機(jī)氮、無(wú)機(jī)氮、固氮微生物（空氣中的氮）

無(wú)機(jī)元素：酶活、生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)輔助物質(zhì)：營(yíng)養(yǎng)缺陷，酵母粉、麥芽汁水分：占細(xì)胞總量的80-90％氣體：氧氣和二氧化碳4.3微生物培養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化：?jiǎn)我蜃訉?shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)、代謝途徑研究?jī)?nèi)容：種類、濃度、比例、緩沖能力和種類粘度、雜質(zhì)影響、誘導(dǎo)物、前體、促進(jìn)劑的加入量、加入時(shí)間和加入方式，各種影響因素相互的作用文獻(xiàn)報(bào)道、菌種基本要求、同類微生物的要求細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)研究微生物的營(yíng)養(yǎng)類型：a.光能自養(yǎng)微生物：光合作用，光為能源，無(wú)機(jī)物作為氫的受體還原二氧化碳合成有機(jī)化合物如：藻類、藍(lán)細(xì)菌等b.光能異養(yǎng)微生物：有機(jī)物為氫受體還原二氧化碳合成有機(jī)物c.化能自養(yǎng)微生物：以無(wú)機(jī)物氧化所產(chǎn)生的化學(xué)能作為能源，以二氧化碳作為碳源合成有機(jī)物如：硝化細(xì)菌、硫細(xì)菌等d.化能異養(yǎng)微生物：大多數(shù)微生物都屬于這類。腐生型和寄生型微生物的培養(yǎng)方法表面培養(yǎng)：類似自然培養(yǎng)固體培養(yǎng)：固體培養(yǎng)基，設(shè)備簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度低液體深層培養(yǎng)：可控性好，設(shè)備投資大，工業(yè)化生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)－新鮮的種子，菌種的分離純化和復(fù)壯一級(jí)種子：搖瓶培養(yǎng)，由斜面培養(yǎng)基中接入二級(jí)種子：種子罐，質(zhì)量檢查，是否染菌多級(jí)種子罐：50立的發(fā)酵罐一般使用三級(jí)發(fā)酵接種菌齡，接種量發(fā)酵：酶、次級(jí)代謝產(chǎn)物，純種培養(yǎng)，產(chǎn)品提取和精制

目的：使菌種的生命得以延續(xù)并保持其生物學(xué)特性

菌種保藏方法：基本原理：根據(jù)微生物的生理、生化特點(diǎn)，人工的創(chuàng)造條件使微生物處于代謝不活潑、生長(zhǎng)繁殖受抑制的休眠狀態(tài)?！蜏亍⒏稍?、缺氧

1.斜面保藏法：4℃可以保藏3-6個(gè)月，到期轉(zhuǎn)接新鮮斜面容易發(fā)生變異、染菌，可覆蓋礦物油

2.穿刺保藏法：用接種針將菌種穿刺接入培養(yǎng)基的1/2處，然后覆蓋無(wú)菌液體石蠟（保持水分、隔絕氧氣）從中接出來(lái)時(shí)要進(jìn)行復(fù)壯4.3菌種保藏

3.干燥保藏法：適用于形成芽孢的細(xì)菌、形成孢子的絲狀真菌和放線菌。原理：將微生物吸附在各種載體上，干燥后保藏。使用時(shí)要進(jìn)行復(fù)壯，常用的為滅菌的沙子和土壤

4.懸液保藏法：將微生物懸浮于不含養(yǎng)分的溶液中，如蒸餾水磷酸緩沖液或生理鹽水中，然后密封保藏

5.冷凍干燥保藏法：保藏期長(zhǎng)，變異小，便于大量保藏，適用范圍廣，是各保藏機(jī)構(gòu)的主要方法原理：將微生物或者孢子冷凍，然后在減壓情況下利用升華原理除去水分，使細(xì)胞的生命活度處于停止?fàn)顟B(tài)，然后進(jìn)行低溫保藏（一般4℃）。

常用分散劑：脫脂牛奶和血清菌種：處于生長(zhǎng)后期的微生物，一般細(xì)菌培養(yǎng)24小時(shí)，酵母培養(yǎng)72小時(shí)，放線菌和絲狀菌種培養(yǎng)7天加入分散劑并刮下微生物菌體或孢子，制成懸液－30℃左右冷凍，真空干燥，使水分升華干燥完畢后，抽真空并熔封。復(fù)壯后使用

6.液氮保藏法：效果好，方法簡(jiǎn)單，保藏對(duì)象最為廣泛