豬瘟活疫苗(傳代細胞源)成品檢驗課件

豬瘟活疫苗（傳代細胞源）

成品檢驗內容：共有九個質量項分別是：物理性狀檢驗、無菌檢驗、支原體檢驗、鑒別檢驗、外源病毒檢驗、安全檢驗、效力檢驗、剩余水分測定和真空度測定。

1物理性狀檢驗本品為淡黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。

2無菌檢驗1按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無菌生長。2用T.G培養(yǎng)基50ml，接種疫苗（先做10倍稀釋）1ml，置37℃培養(yǎng)，3日后吸取培養(yǎng)物，分別接種T.G小管和G.A斜面各2支，每支0.2ml，1支置37℃，1支置25℃，另取0.2ml，接種一支G.P小管，置25℃，均培養(yǎng)7日，應無菌生長。

無菌檢驗-抽樣

1應隨機取樣并注意代表性。2按每批或每個亞批進行，每批按瓶數的百分之一抽樣，但不應少于5瓶，最多不超過10瓶，每瓶分別進行檢驗。3支原體檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無支原體生長。檢測豬瘟活疫苗（傳代細胞源）用支原體培養(yǎng)基（見《中國獸藥典》附錄24、25頁）。3.1樣品處理：每批制品取樣5瓶，加液體培養(yǎng)基或生理鹽水復原成混懸液后混合。3.2接種與觀察：每個樣品需同時用以下兩種方法檢測。3支原體檢驗3.2.1液體培養(yǎng)基培養(yǎng)將疫苗混合物5.0ml接種裝有20ml液體培養(yǎng)基的小瓶，搖勻后，再從小瓶中取0.4ml

移植到含有1.8ml培養(yǎng)基的2支小管（1.0cm×10cm），每支各接種0.2ml，將小瓶與小管置37℃培養(yǎng)，分別于接種后5日、10日、15日從小瓶中取0.2ml培養(yǎng)物移植到小管液體培養(yǎng)基內，每日觀察培養(yǎng)物有無顏色變黃或變紅，如果無變化，則在最后一次移植小管培養(yǎng)、觀察14日后停止觀察。3支原體檢驗3.2.1在觀察期內，如果發(fā)現小瓶或任何一支小管培養(yǎng)物顏色出現明顯變化，在原pH值變化達±0.5時，應立即將小瓶中的培養(yǎng)物移植于小管液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，觀察在液體培養(yǎng)基中是否出現恒定的pH變化，及固體上有無典型的“煎蛋”狀支原體菌落。

3支原體檢驗3.2.2瓊脂固體平板培養(yǎng)在每次液體培養(yǎng)物移植小管培養(yǎng)的同時，取培養(yǎng)物0.1~0.2ml接種于瓊脂平板，置含5%~10%CO2、潮濕的環(huán)境、37℃下培養(yǎng)。在液體培養(yǎng)基顏色出現變化，在原pH值變化達±0.5時，也同時接種瓊脂平板。每3~5日，在低倍顯微鏡下，觀察檢查各瓊脂平板有無支原體菌落出現，經14日觀察，仍無菌落者時，停止觀察。3支原體檢驗3.3每次檢查需同時設陰、陽性對照，在同條件下培養(yǎng)觀察。檢測豬瘟活疫苗（傳代細胞源）疫苗，用豬鼻支原體作為陽性對照。3.4結果判定3.4.1接種樣品的任何一個瓊脂平板上出現支原體菌落時，判疫苗不合格。3.4.2陽性對照中至少有一個平板出現支原體菌落，而陰性對照中無支原體生長，則檢驗有效。3支原體檢驗3.4結果判定3.4.1接種樣品的任何一個瓊脂平板上出現支原體菌落時，判疫苗不合格。3.4.2陽性對照中至少有一個平板出現支原體菌落，而陰性對照中無支原體生長，則檢驗有效。4鑒別檢驗中和試驗將疫苗用滅菌生理鹽水稀釋成為每毫升含有100個兔MID的病毒懸液，與等量的抗豬瘟病毒特異性血清充分混合，置10~15℃作用60分鐘，其間振搖2～3次。同時設立病毒對照和生理鹽水對照。4鑒別檢驗注射、觀察與判定中和結束后，分別耳靜脈注射兔2只，每兔1.0ml，按效力檢驗（1）項進行觀察和判定。除病毒對照組應出現熱反應外，其余2組在接種后120小時內不出現熱反應。5外源病毒檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無外源病毒污染。5.1樣品處理取樣品2~3瓶，將樣品混合，用相應的特異性陽性血清中和后作為檢品。5.2細胞的選擇與樣品培養(yǎng)5.2.1細胞的選擇Vero、MDBK、ST傳代細胞5外源病毒檢驗5.2.2樣品的接種與培養(yǎng)（1）至少1.0ml（制品至少含10頭份）已處理被檢樣品應接種到已長成良好單層的上述細胞，另至少設一瓶正常細胞對照。（2）細胞培養(yǎng)物傳代方式：上一代細胞培養(yǎng)物凍融3次后接種新細胞單層的方式繼代，至少繼代一次，總培養(yǎng)時間應不少于14日。最后一次繼代的細胞單層數量和培養(yǎng)面積應符合熒光抗體檢查法、致細胞病變檢查法和紅細胞吸附性外源病毒檢驗的要求。5外源病毒檢驗

5.2.3判定在至少14日的培養(yǎng)期內，要對細胞培養(yǎng)物進行常規(guī)檢查，如果培養(yǎng)期間出現細胞病變，則判為不符合規(guī)定。如無細胞病變，培養(yǎng)結束時，細胞單層應按5.2.4進行檢驗。

5外源病毒檢驗5.2.4檢查方法使用BVDV、PPV熒光抗體。5.2.4.1熒光抗體檢查法最后一次繼代的細胞單層應培養(yǎng)5~7日后用于熒光抗體檢查。對每一種特定外源病毒的檢驗應至少含三組細胞單層：（1）被檢樣品細胞培養(yǎng)物；（2）在最后一次繼代時接種100~300FAID50特定病毒的陽性對照；（3）正常細胞對照。每一組細胞單層檢查面積應不小于6.0cm2。5外源病毒檢驗熒光檢查判定細胞單層樣品經丙酮固定后，用適宜的熒光抗體進行染色，檢查每一組單層是否存在特定外源病毒的熒光。當陽性對照出現特異熒光，正常細胞無熒光時，如果被檢樣品出現外源性病毒特異性熒光，判為不合格。如果陽性對照組熒光不明顯，或者正常細胞出現不明顯熒光，判為無結果，應重檢。5外源病毒檢驗5.2.4.2致細胞病變檢查法取經傳代培養(yǎng)至少7日的敏感細胞單層（每個至少6.0cm2

）進行檢驗。用適宜染色液對細胞單層進行染色。觀察細胞單層，檢查包涵體、巨細胞或其他由外源病毒引起的CPE的出現情況。如果出現外源病毒所致的特異性CPE，判為不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通過其他試驗排除這種可能性時，則判為不合格。5外源病毒檢驗5.2.4.3紅細胞吸附性外源病毒檢驗取經傳代后至少培養(yǎng)7日的細胞單層（每個至少6.0cm2

）進行檢驗。以PBS洗滌細胞單層2~3次。加入適量0.2%的豚鼠紅細胞和雞紅細胞的等量混合懸液，以覆蓋整個單層表面為準，紅細胞懸液可在加入前混合，亦可分別滴加于不同的細胞單層上。5外源病毒檢驗5.2.4.3選2個細胞單層，分別在2~8℃和20~25℃放置30分鐘，用PBS洗滌，檢查紅細胞吸附情況。若出現外源病毒所致的紅細胞吸附現象，判為不合格；若疑有外源病毒污染，又不能通過其他試驗排除這種可能性時，則判為不合格。6安全檢驗6.1豬瘟病毒中和試驗方法6.1.1先測定豬瘟病毒兔化弱毒(抗原)對兔的最小感染量（MID）。試驗時，將抗原用滅菌生理鹽水稀釋成100個兔MID/ml，作為工作抗原(如果抗原對兔的MID為10-5.0/ml，則將抗原稀釋成1000倍使用)。6安全檢驗

6.1.2將被檢豬血清分別用滅菌生理鹽水作2倍稀釋，與含有100個兔MID/ml的工作抗原等量混合，搖勻后，置10~15℃中和2小時，其間振搖2~3次。同時設含有相同工作抗原量加等量生理鹽水(不加血清)的對照組，與被檢組在同樣條件下處理。6安全檢驗6.1.3中和完畢，被檢組各注射兔1~2只，對照組注射兔2只，每只兔耳靜脈注射l.0ml，觀察體溫反應，并判定結果。6安全檢驗6.1.4結果判定體溫反應標準同效力檢驗項。當對照組2只兔均呈定型熱反應(++)，或1只兔呈定型熱反應(++)、另一只兔呈輕熱反應(+)時，方能判定結果。被檢組如果用1只兔，須呈定型熱反應；如果用2只兔，每只兔應呈定型熱或輕熱反應，被檢血清判為陰性。6安全檢驗6.1.5注意如被檢組用2只兔，其中1只兔無反應或呈可疑反應時，可采血復歸或對2只兔進行攻毒。如被檢血清出現陽性反應或復歸兔仍為可疑反應時，則該頭被檢豬不得用于豬瘟疫苗的安全(或效力)檢驗。被檢組用1只兔時，不得復歸或攻毒。用中和試驗方法選擇易感豬，無論是否同窩豬，均須逐頭檢測。6安全檢驗6.2測常溫及安全檢驗注射劑接種前觀察5～7日，每日上、下午各測體溫1次。挑選體溫、精神、食欲正常的易感豬使用。每批疫苗按瓶簽注明頭份用滅菌生理鹽水稀釋成每毫升含6頭份，肌肉注射豬5頭，每頭5.0ml(含30頭份)。6安全檢驗6.3測溫及判定接種后，每日上、下午各觀察并測體溫1次，觀察21日。體溫、精神、食欲與接種前相比沒有明顯變化；或體溫升高超過0.5℃，但不超過l℃，稽留不超過4個溫次；或減食不超過l日，疫苗可判為合格。如果有l(wèi)頭豬體溫超過常溫l℃以上，但不超過1.5℃，稽留不超過2個溫次，疫苗也可判為合格。6安全檢驗6.3測溫及判定如果有1頭豬的反應超過上述標準；或出現可疑的其他體溫反應和其它異?，F象時，可用5頭豬重檢1次。重檢的豬仍出現同樣反應，疫苗應判為不合格。6安全檢驗6.3測溫及判定也可在豬高溫期采血復歸豬2頭，每頭肌肉注射可疑豬原血5.0m1，測溫觀察16日。如果均無反應，疫苗可判合格。如果第1次檢驗結果已經確證疫苗不安全，則不應進行重檢。7效力檢驗下列方法任擇其一7.1用兔效檢按瓶簽注明頭份，用無菌生理鹽水將每頭份疫苗稀釋1/7500頭份/ml，耳靜脈注射體重為1.5～3.0kg兔2只，每只l.0ml。接種后，上、下午各測體溫1次，48小時后，每隔6小時測體溫1次，根據體溫反應和攻毒結果進行綜合判定。7效力檢驗7.1.1兔接種疫苗后，體溫反應標準如下：定型熱反應(++)潛伏期48～96小時，體溫上升呈明顯曲線，至少有3個溫次超過常溫1℃以上，并稽留18～36小時。如稽留42小時以上，必須攻毒，攻毒后無反應可判為定型熱。輕熱反應(+)潛伏期48～96小時，體溫上升呈明顯曲線，至少有2個溫次超過常溫0.5℃以上，并稽留12～36小時?？梢煞磻?

)潛伏期48～96小時，體溫曲線起伏不定，稽留不到12小時；或潛伏期在24小時以上，不足48小時及超過96小時至120小時出現熱反應。體溫反應呈二次高峰，有一次高峰符合定型熱反應(++)或輕熱反應(+)標準者，均須攻毒。攻毒后無反應時，該兔熱反應可判為定型熱或輕熱反應。無反應(－)體溫正常。7效力檢驗7.1.2結果判定：注苗后，當2只兔均呈定型熱反應(++)，或1只兔呈定型熱反應(++)、另1只兔呈輕熱反應(+)時，疫苗判為合格。注苗后，當1只兔呈定型熱反應(++)或輕熱反應(+)，另1只兔呈可疑反應(

)；或2只兔均呈輕熱反應(+)時，可在注苗后7～10日攻毒(接種新鮮脾淋毒或凍干毒)。攻毒時，加對照兔2只，攻毒劑量為50～100倍乳劑。每兔耳靜脈注射1ml。7效力檢驗攻毒后的體溫反應標準如下：熱反應(+)潛伏期24～72小時，體溫上升呈明顯曲線，超過常溫1℃以上，稽留12～36小時?？梢煞磻?

)潛伏期不到24小時或72小時以上，體溫曲線起伏不定，稽留不到12小時或超過36小時而不下降。無反應(－)體溫正常。攻毒后，當2只對照兔均呈定型熱反應(++)，或1只兔呈定型熱反應(++)，另1只兔呈輕熱反應(+)，而2只注苗兔均無反應(－)，疫苗判合格。7效力檢驗注苗后，如有1只兔呈定型熱(++)或輕熱反應(+)，另1只兔呈可疑反應(

)或無熱反應(－)