蛋白質(zhì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)一低溫豆粕提取大豆分離蛋白原理大豆分離蛋白的提取是根據(jù)大豆中所含的蛋白質(zhì)在不同的pH時(shí)有不同的溶解度的特性而實(shí)現(xiàn)的。大豆粕中所含的蛋白質(zhì)大部分都能溶解在水中，在pH6.5的蒸餾水中有很高的溶解度，且都能溶解于0.2%的堿液中，相反，在pH4.5時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度非常小。所以大豆分離蛋白的提取是先用水或稀堿液從低溫豆粕中萃取可溶物，用離心機(jī)分離出不溶物（豆粕渣）然后在萃取液（豆乳）中加酸（鹽酸、磷酸、醋酸等）調(diào)節(jié)pH到4.2-4.5，于是蛋白質(zhì)即從萃取液中沉淀出來(lái)，傾除清夜（即乳清、主要是低分子糖類、蛋白質(zhì)等），將下層的蛋白質(zhì)凝聚物進(jìn)行水洗、濃縮、干燥即可得到等電點(diǎn)分離蛋白。試劑及儀器1）氫氧化鈉AR級(jí)2）鹽酸AR級(jí)3）電熱恒溫水浴鍋4）電熱恒溫干燥箱5）離心沉淀機(jī)6）酸度計(jì)7）多功能電動(dòng)攪拌器三、實(shí)驗(yàn)步驟在1000ml燒杯中將50克豆粕按料液比1：10的比例與水混合，溫度50℃，低速攪拌30-35rpm，用1N氫氧化鈉pH調(diào)至7.5，繼續(xù)攪拌30分鐘。懸浮液在2000rpm轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，回收上清液，沉淀（豆渣）棄去。上清液邊攪拌邊加入1NHCl（30-35rpm），將pH調(diào)至4.5，溫度30℃稱取5克（精確到0.001克）于表面皿中，在105℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，測(cè)定凝乳的水分含量，烘干后的凝乳存放于干燥器內(nèi)保藏。其余濕凝乳置于-15習(xí)題1.求凝乳分離蛋白產(chǎn)品的含水量、蛋白含量2.求分離蛋白生產(chǎn)過(guò)程的提取率、蛋白回收率、蛋白純度一般是多少3.為了提高蛋白提取率，在萃取、漿渣分離等操作中可采取什么措施？實(shí)驗(yàn)二凱氏定氮法測(cè)定大豆分離蛋白中蛋白質(zhì)的含量一、原理濃硫酸和樣品及催化劑一起加熱沸騰，樣品中蛋白質(zhì)分解，其含的N變成（NH4）2SO4,堿化并蒸餾使NH3放出，將NH3蒸入酸溶液，在以標(biāo)準(zhǔn)酸來(lái)滴定，測(cè)得樣品中的含氮量，從而得出樣品中蛋白質(zhì)含量，其反應(yīng)式如下：二、儀器1）萬(wàn)分之一分析天平2）飽和氫氧化鈉溶液3）2%硼酸溶液4）溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑5）催化劑：CuSO4?5H2O―K2SO4（1：10）6）濃硫酸：比重1.84、無(wú)氮7）蔗糖：分析純8）雙氧水硫酸混合溶液9）大豆粕、大豆分離蛋白四、實(shí)驗(yàn)步驟1）稱樣：稱取約0.1克試樣（烘干凝乳）準(zhǔn)確到0.0001克。2）消煮：將試樣置于50ml凱氏燒瓶中，加入催化劑粉末1克，雙氧水混合液3ml，輕輕搖動(dòng)凱氏燒瓶使試樣被硫酸潤(rùn)濕，將凱氏燒瓶中的液體連續(xù)沸騰，沸騰在瓶頸中部冷凝回流，待溶液消煮到無(wú)微小的碳粒呈透明的藍(lán)綠色時(shí)，在繼續(xù)消煮30-60分鐘，稍冷后加入少量蒸餾水，結(jié)束消煮，冷卻后傾入50ml容量瓶中，再用水稀釋到刻度，搖勻，備用。3）蒸餾：以0.01N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定錐形瓶中的溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛易仙珵榻K點(diǎn)。5）空白：用0.1克蔗糖代替樣品作空白測(cè)定，消耗鹽酸溶液的體積不得超過(guò)0.3ml。五、計(jì)算式中：―滴定試樣時(shí)消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積（ml）―滴定空白時(shí)消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積（ml）N―標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的當(dāng)量濃度6.25―將氮換算成粗蛋白質(zhì)的系數(shù)0.014―每毫克當(dāng)量氮的克數(shù)W―試樣重量（克）M―試樣水分含量平行測(cè)定的結(jié)果可取算術(shù)平均值，保留小數(shù)后二位。六、注意1）加堿蒸餾時(shí)如有氧化銅棕色沉淀發(fā)生，說(shuō)明加堿量已足夠。2NaOH+CuSO4→Cu(OH)2+Na2SO4Cu(OH)2→CuO↓+H2O2)把吸收瓶裝好后再加堿免NH3，逃逸。習(xí)題1.如果用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸吸收，要完成實(shí)驗(yàn)，應(yīng)增加什么步驟？2.如何檢查蒸餾是否完全？如果用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸吸收，定氮實(shí)驗(yàn)中要增加什么步驟？測(cè)定氨基酸時(shí)也要進(jìn)行水解，與定氮實(shí)驗(yàn)中消化水解過(guò)程有什么區(qū)別？3.整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，下列那些操作要十分精確，那些可不十分嚴(yán)格？樣品稱量，硼酸體積，飽和NaOH用量，蒸餾時(shí)間，硫酸消化液用量，蒸餾裝置氣密性實(shí)驗(yàn)三差示紫外光譜法測(cè)定大豆蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性一、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)變性使分子中酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生變化，從而引起紫外吸收波長(zhǎng)改變。由于這種變化較小，直接測(cè)定時(shí)誤差較大，而紫外差示光譜法則可以將光譜曲線的微小變化放大，減少測(cè)定的誤差。本實(shí)驗(yàn)以鹽酸胍作為變性劑，測(cè)定280nm處紫外差示吸收ΔA280隨變性劑濃度的變化情況。從紫外差吸收可以計(jì)算出蛋白質(zhì)在不同變性劑濃度下的變性的分?jǐn)?shù)，再經(jīng)過(guò)作圖，將變性劑濃度外推到0即為蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性。二、實(shí)驗(yàn)材料1.鹽酸胍（分析純）2.大豆蛋白質(zhì)凝乳三、儀器設(shè)備離心機(jī)、燒杯（250ml）、紫外分光光度計(jì)、0.5cm石英比色皿、旋渦混合器、具塞試管10ml、試管架、移液管、電磁攪拌器、pH計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、塑料保鮮膜。四、樣品制備1.稱取濕凝乳10克，置于250ml燒杯中，加入30ml水，待完全分散后用1NNaOH溶液將pH調(diào)至7.0，電磁攪拌10分鐘。然后于3000rpm離心10分鐘，后所得上清液即為大豆蛋白儲(chǔ)備液。2.制備6.67mol/L鹽酸胍儲(chǔ)備溶液。五、實(shí)驗(yàn)操作方法1.取10ml試管1支，加入大豆蛋白儲(chǔ)備溶液0.5ml，然后加入蒸餾水4.5ml。2.取10ml試管10支，分別加入大豆蛋白儲(chǔ)備溶液0.5ml，然后分別加入蒸餾水4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0.0ml，再分別加入鹽酸胍儲(chǔ)備溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5ml，制備成變性劑濃度不同的蛋白質(zhì)溶液。3.另外取10ml試管10支，分別加入蒸餾水5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5ml，然后分別加入鹽酸胍儲(chǔ)備溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5ml制備濃度不同的變性劑溶液。4.將上述試管用保鮮膜將管口封住后在25℃5.按下圖方法分別測(cè)定280nm處的紫外吸收ΔA6.記錄不同變性劑濃度時(shí)的紫外吸收。0.023、0.023、0.021、0.024、0.019、0.027、0.014、0.011、0.011、0.0087.計(jì)算fu=(ΔA6M—ΔA)/（(ΔA6M—ΔA0)，K=fu/（1-fu）與幻不同，ΔG=―RTlnK8.以ΔG對(duì)變性劑濃度作圖，將變性劑濃度外推到0，求出大豆蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)+變性劑蛋白質(zhì)+變性劑水蛋白質(zhì)溶液變性劑溶液樣品光路參比光路實(shí)驗(yàn)四大豆分離蛋白亞基分子量的測(cè)定SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳法一、實(shí)驗(yàn)材料低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒：分子量范圍14000～97000。濕凝乳。二、儀器設(shè)備電泳儀、垂直板電泳槽、微量進(jìn)樣器（70μl）、培養(yǎng)皿（12-14cm）、長(zhǎng)滴管、移液管、酸度計(jì)、小燒杯（20ml）。三、電泳試劑的配制1.四甲基乙二胺（TEMED）原液；2.10%（W/V）SDS溶液：稱5克SDS，加重蒸水至50ml，微熱使其溶解。3.10%（W/V）過(guò)硫酸銨（AP）：稱取AP1克，加重蒸水至10ml。臨用前配制。4.凝膠貯液30%分離膠貯液：稱取丙烯酰胺30克，甲叉雙丙烯酰胺0.8克，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，過(guò)濾后置于棕色瓶中備用。10%濃縮膠貯液：稱取丙烯酰胺10克，甲叉雙丙烯酰胺0.5克5.凝膠緩沖液分離膠緩沖液（3.0mol/LpH8.9Tris-HCL緩沖液）：稱Tris36.3g，加少許重蒸水使其溶解，再加1mol/LHCL約48ml調(diào)pH至8.9，最后加重蒸水定容至100ml。濃縮膠緩沖液（0.5mol/LpH6.7Tris-HCL緩沖液）：稱Tris6.0g，加少許重蒸水使其溶解，再加1mol/LHCL約48ml調(diào)pH至6.7，最后加重蒸水定容至100ml。6.電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g,甘氨酸28.87.1%瓊脂糖溶液：稱瓊脂糖1克，加電極緩沖液100ml，加熱使其溶解。8.固定液：取50%的甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。9.染色液：稱考馬斯亮藍(lán)R-2500.125g，加上述固定液25010.脫色液：冰乙酸75ml，加蒸餾水定容至1000ml。五.樣品制備1.樣品溶解液的配制：內(nèi)含2%SDS，5%的巰基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚藍(lán)，0.01mol/LpH8.0Tris-HCL緩沖液。先配制0.05mol/LpH8.0Tris-HCL緩沖液：稱Tris0.6g，加50ml重蒸水使其溶解，再加1mol/LHCL約3ml調(diào)pH至8.0，最后加重蒸水定容至100ml。再按下表配制樣品溶解液：10%SDS巰基乙醇溴酚藍(lán)甘油0.05mol/LTris-HCL加水至總體積為2ml0.5ml2mg1ml2ml10ml2.樣品處理：稱取濕凝乳50mg，溶于10ml樣品溶解液中，攪拌提取30分鐘，然后于3000轉(zhuǎn)每分離心10分鐘，取上清液上樣。六.實(shí)驗(yàn)操作方法1.安裝夾心式垂直板電泳槽：（1）將長(zhǎng)、短玻璃板分別插到橡膠框的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。（2）將已插好玻璃板的橡膠模插入電泳槽中，雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽。（3）豎直電泳槽，在長(zhǎng)玻璃板下端與硅橡膠框交界的縫隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂糖。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂糖中應(yīng)避免有氣泡。2.配膠：根據(jù)所測(cè)蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。入下表所示：試劑名稱配制20ml不同濃度分離膠所需各試劑用量/ml配制10ml濃縮膠所需各試劑用量/ml5%7.5%10%15%4%分離膠貯液3.335.006.6610.00―分離膠緩沖液2.52.502.502.50―濃縮膠貯液――――4濃縮膠緩沖液――――1.2510%SDS0.200.200.200.200.10TEMED7μl7μl7μl7μl5μl重蒸水13.912.310.67.34.60混勻后，置真空干燥器中抽氣10分鐘10%AP40μl40μl40μl40μl20μl注：AP的用量根據(jù)室溫酌量添加。3.凝膠板的制備（1）分離膠的制備：按上表配制20ml10%的分離膠，加AP混勻后用細(xì)長(zhǎng)頭滴管將凝膠液加至長(zhǎng)、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約8cm高，用1ml注射器取少許蒸餾水，沿長(zhǎng)玻璃板板壁緩慢注入，約3-4mm高，以進(jìn)行水封。約40min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。（2）濃縮膠的制備：按上表配制10ml4%的濃縮膠，用細(xì)長(zhǎng)頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上端約0.5cm處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，越30min后凝膠聚合，再過(guò)20-30min使凝膠“老化”。小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去槽內(nèi)多余水分，將pH8.3的電極緩沖液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒(méi)過(guò)短板約0.5cm以上，即可準(zhǔn)備加樣。3.加樣用微量注射器吸取10-15μl處理過(guò)的樣品上清液，通過(guò)電極緩沖液伸入加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，輕輕推動(dòng)微量注射器，注意針頭勿碰破凹形槽膠面。4.電泳將電泳槽的短板接負(fù)極，長(zhǎng)板接正極，開(kāi)始電泳。開(kāi)始電流為10mA左右，待樣品進(jìn)入分離膠后改為20-30mA，當(dāng)染料前沿距橡膠框底邊1.5cm時(shí)，停止電泳。5.凝膠板剝離與固定電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下橡膠框，用鑷子撬開(kāi)短玻璃板，在凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)志。在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記，將凝膠板放入大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入固定液，固定過(guò)夜。6.染色與脫色將染色液倒入培養(yǎng)皿內(nèi)染色1小時(shí)左右，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對(duì)遷移率。七.結(jié)果計(jì)算將大培養(yǎng)皿放在一張坐標(biāo)紙上，量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離，以及各樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離。按下式計(jì)算相對(duì)遷移率mR：計(jì)算相對(duì)遷移率m計(jì)算相對(duì)遷移率mR=蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量為縱坐標(biāo)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)樣品相對(duì)遷移率可直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量習(xí)題1.聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)等生物大分子的基礎(chǔ)是什么？2.本實(shí)驗(yàn)中，緩沖體系是十分重要的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)電荷量的大小是由體系的PH決定，對(duì)否3.聚丙烯酰胺凝膠電泳的另一個(gè)重要內(nèi)容，是測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，請(qǐng)敘述其原理。實(shí)驗(yàn)五氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定大豆分離蛋白一、原理氨基酸的組成分析，現(xiàn)代廣泛地采用離子交換法，并由自動(dòng)化的儀器來(lái)完成。其原理是利用各種氨基酸的酸堿性、極性和分子量大小不同等性質(zhì)，使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在色譜柱上進(jìn)行分離。當(dāng)樣液加入色譜柱頂端后，采用不同的pH值和離子濃度的緩沖液即將它們依次洗脫下來(lái)，即先是酸性氨基酸和極性較大的氨基酸，其次是非極性的和芳香性氨基酸，最后是堿性氨基酸；分子量小的比分離量大的先被洗脫下來(lái)，洗脫下來(lái)的氨基酸可用茚三酮顯色，從而定量各種氨基酸。定量測(cè)定的依據(jù)是氨基酸和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與各有關(guān)氨基酸的含量成正比。但輔氨酸和羥輔氨酸則生成黃棕色化合物，故需在另外波長(zhǎng)處定量測(cè)定。陽(yáng)離子交換樹(shù)脂是由聚苯乙烯與二乙烯苯經(jīng)交聯(lián)在磺化而車成，其交聯(lián)度為8。二、儀器氨基酸自動(dòng)分析儀三、實(shí)驗(yàn)步驟樣品處理：測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成時(shí)樣品必須經(jīng)酸水解，使蛋白質(zhì)完全變成氨基酸后才能上柱進(jìn)行分析。酸水解的方法：稱取經(jīng)干燥凝乳數(shù)毫克，加入2ml5.7mol/L鹽酸，置于110℃樣品分析：經(jīng)過(guò)處理后的樣品上柱進(jìn)行分析。上柱的樣品量視所用自動(dòng)分析儀的靈敏度而定。一般為每種氨基酸0.1μmol左右（水解樣品干重為0.3mg左右）。對(duì)于一些未知蛋白質(zhì)含量的樣品，水解后必須預(yù)先測(cè)定氨基酸的大致含量后才能分析，否則會(huì)出現(xiàn)過(guò)