第9章 動(dòng)物基因工程

第九章動(dòng)物基因工程

基因工程技術(shù)由細(xì)胞水平發(fā)展到動(dòng)物整體水平，人們可以將單一功能基因或基因簇引入高等動(dòng)物的染色體DNA中，實(shí)現(xiàn)了種系內(nèi)和種系間的基因轉(zhuǎn)移，并由此構(gòu)建出各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。動(dòng)物基因工程也由此分為動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)和動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)兩個(gè)層次，前者主要利用動(dòng)物工程細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)蛋白多肽物質(zhì)或作為藥物篩選研究的體外（invitro）評(píng)價(jià)模型。而后者則通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體進(jìn)行動(dòng)物遺傳性狀的改良或作為藥物篩選研究的體內(nèi)（invivo）評(píng)價(jià)模型及人體的基因治療。第一節(jié)動(dòng)物細(xì)胞基因工程

采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白表達(dá)具有以下主要優(yōu)點(diǎn)：①哺乳動(dòng)物細(xì)胞能識(shí)別和除去外源基因的內(nèi)含子，剪接加工成成熟的mRNA；②哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白，加工后的蛋白質(zhì)免疫原性好，約為酵母型的16~20倍；③哺乳動(dòng)物細(xì)胞易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性；④經(jīng)轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可將表達(dá)的產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，提純工藝簡(jiǎn)單，成本低。

一、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要由宿主細(xì)胞和表達(dá)載體兩部分組成。1表達(dá)載體目前常用的表達(dá)載體分為病毒載體與質(zhì)粒載體。病毒載體是以病毒顆粒的方式，通過(guò)病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞膜的相互作用使外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。常用的病毒載體有：（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）載體（2）腺病毒（Adenovirus，AV）載體（3）腺相關(guān)病毒（Adeno-associatedVirus，AAV）載體（4）質(zhì)粒載體2宿主細(xì)胞雖然至今批準(zhǔn)的由動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品，其宿主細(xì)胞幾乎都是CHO細(xì)胞。但是在實(shí)踐中，人們發(fā)現(xiàn)它也存在著一些不足，因此，近來(lái)一些具有良好特征的細(xì)胞系都已被作為宿主細(xì)胞試用于真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中。（1）BHK-21細(xì)胞該細(xì)胞最早從地鼠幼鼠的腎臟分離，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的是采用單細(xì)胞分離技術(shù)經(jīng)13次克隆的細(xì)胞。原始的細(xì)胞株是成纖維樣細(xì)胞，并且具有貼壁依賴性，但經(jīng)無(wú)數(shù)次傳代后細(xì)胞可懸浮生長(zhǎng)。

（2）CHO-K1細(xì)胞該細(xì)胞是CHO細(xì)胞的一株缺乏二氫葉酸還原酶（dhfr—）的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變株，它可以在氨甲蝶呤(MTX）壓力下使外源基因的基因拷貝數(shù)擴(kuò)增，使外源蛋白質(zhì)得到較高水平表達(dá)。

（3）C127細(xì)胞該細(xì)胞來(lái)自RIII小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞，適用于帶有牛乳頭瘤病毒（BPV）載體的轉(zhuǎn)染。當(dāng)用BPV-1病毒載體轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)可發(fā)生顯著變化，因此轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞可通過(guò)特有的轉(zhuǎn)化形態(tài)加以識(shí)別。

（4）MDCK細(xì)胞該細(xì)胞是從成年雌性的西班牙長(zhǎng)耳狗的腎臟分離獲得，是具有貼壁依賴性的上皮樣細(xì)胞，已成功地在微載體上增殖。該細(xì)胞能支持多種病毒的增殖，已被用來(lái)生產(chǎn)獸用疫苗。

（5）Namalwa細(xì)胞該細(xì)胞是一株人的類淋巴母細(xì)胞,來(lái)自名為“Namalwa”的Burkitt淋巴瘤患者，含有部分皰疹病毒基因，但不產(chǎn)生皰疹病毒。該細(xì)胞已被批準(zhǔn)用于大規(guī)模生產(chǎn)α干擾素，可以用無(wú)血清培養(yǎng)基在懸浮狀態(tài)下高密度培養(yǎng)，可有效地表達(dá)外源基因。

（6）Vero細(xì)胞該細(xì)胞是從正常的成年非洲綠猴腎分離獲得的，一株具有貼壁依賴性的成纖維細(xì)胞?？沙掷m(xù)地進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并可支持多種病毒的增殖并制成疫苗。（7）鼠骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞是“專業(yè)”的分泌細(xì)胞，在培養(yǎng)上清中可產(chǎn)生高達(dá)100mg/L的免疫球蛋白（Ig），而且容易轉(zhuǎn)染，容易生長(zhǎng)，可在無(wú)血清培養(yǎng)基中高密度的懸浮培養(yǎng)；能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化修飾；高效表達(dá)Ig基因的調(diào)控成分明確，有利于表達(dá)載體的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的合理設(shè)計(jì)。

（8）COS細(xì)胞該細(xì)胞是利用復(fù)制起點(diǎn)缺失的SV40轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細(xì)胞CV-1而獲得，具有COS-1、-3、和-7三個(gè)細(xì)胞系。由于COS細(xì)胞來(lái)源廣，易培養(yǎng)，易轉(zhuǎn)染；能組成性表達(dá)SV40大T抗原，能使大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞攜帶有復(fù)制子的質(zhì)粒以附加體形式高拷貝擴(kuò)增；大量擴(kuò)增的質(zhì)粒及其高表達(dá)的mRNA和蛋白質(zhì)，容易回收和分析，因此被廣泛地用于瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。二、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)受整合目的基因的染色體區(qū)域的狀態(tài)、目的基因的拷貝數(shù)及目的基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后加工修飾效率的影響。構(gòu)建一個(gè)高效表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，應(yīng)從表達(dá)載體在染色體上整合位點(diǎn)的優(yōu)化，轉(zhuǎn)錄翻譯效率的提高以及目的基因拷貝數(shù)的增加等方面綜合考慮。下面分別從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的調(diào)控元件、整合位點(diǎn)的優(yōu)化以及增加目的基因拷貝數(shù)等方面對(duì)此作一介紹。1.轉(zhuǎn)錄水平在目的基因拷貝數(shù)一定，整合位點(diǎn)固定的情況下，轉(zhuǎn)錄作為基因表達(dá)的第一步，提高轉(zhuǎn)錄效率對(duì)一個(gè)高效表達(dá)載體的構(gòu)建來(lái)說(shuō)顯得尤為重要。啟動(dòng)子及其相應(yīng)增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)及多聚腺苷酸加尾信號(hào)對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的高低及mRNA的穩(wěn)定性有很大影響，其中強(qiáng)啟動(dòng)子、強(qiáng)增強(qiáng)子是提高轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)鍵因素。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)基因的特異調(diào)控序列，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)或?qū)⑥D(zhuǎn)錄作用因子募集至啟動(dòng)子從而啟始基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。因此，提高宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平也能增強(qiáng)目的基因的表達(dá)。2.翻譯水平除了轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控外，翻譯水平的調(diào)控和翻譯產(chǎn)物的加工修飾的效率等也對(duì)目的基因的表達(dá)產(chǎn)生重要的影響。Ploy（A）的存在不但能影響mRNA穩(wěn)定性，而且也能部分起“翻譯增強(qiáng)子”的作用，提高mRNA翻譯水平；內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）能使同一mRNA中除第1個(gè)基因之外的其他基因也得到有效表達(dá)；翻譯增強(qiáng)子可提高翻譯效率；通過(guò)使用宿主細(xì)胞偏好的密碼子來(lái)對(duì)目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化也可以大幅度提高翻譯效率。3.整合位點(diǎn)的優(yōu)化目的基因在細(xì)胞染色體上整合位點(diǎn)區(qū)域的狀態(tài)對(duì)于目的基因的表達(dá)與否、表達(dá)高低以及目的基因在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性起著決定性的作用。只有那些整合位點(diǎn)處于染色體轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)的細(xì)胞形成的克隆才可高水平表達(dá)目的基因。因此，保證將表達(dá)載體整合在細(xì)胞染色體上轉(zhuǎn)錄活躍位點(diǎn)的克隆被挑選出來(lái)，是提高細(xì)胞表達(dá)水平必需的一步，主要通過(guò)以下幾種策略實(shí)現(xiàn)。

一是通過(guò)選擇基因（如neo、dhfr）的弱化表達(dá)；二是在載體上添加染色體上的某些特定序列，使表達(dá)載體整合到宿主細(xì)胞的染色體后能模擬染色體的高轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)；三是先將含有定點(diǎn)重組位點(diǎn)的選擇標(biāo)記基因整合在染色體高表達(dá)區(qū)，然后將表達(dá)目的基因的表達(dá)載體和表達(dá)重組酶載體共轉(zhuǎn)染上述帶有重組位點(diǎn)的細(xì)胞系。4增加目的基因拷貝數(shù)單拷貝或低拷貝目的基因，無(wú)論表達(dá)載體調(diào)控元件如何優(yōu)化、整合的染色體位點(diǎn)多么合適，其外源基因表達(dá)量都是有限的。因此，通過(guò)增加目的基因拷貝數(shù)來(lái)獲得高表達(dá)重組藥物的工程細(xì)胞株是基因工程藥物研究中不可或缺的一步。目的基因的擴(kuò)增常采用目的基因和選擇標(biāo)記基因共擴(kuò)增的方法，

三、動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法與篩選1基因的導(dǎo)入方法在真核細(xì)胞的表達(dá)研究中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染是一個(gè)關(guān)鍵步驟。在基因治療中，也需要用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入外源基因。因此該技術(shù)的研究已越來(lái)越受到重視，至今已開(kāi)發(fā)了許多新的技術(shù)和方法。不同的細(xì)胞系，攝取和表達(dá)外源DNA的能力可相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)。因此如果采用某種特定的細(xì)胞系，就務(wù)必比較幾種不同方法的效率。當(dāng)前用于DNA轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的主要方法見(jiàn)下表。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)物理方法光穿孔簡(jiǎn)單，細(xì)胞傷害小需專門儀器沖擊波簡(jiǎn)單，可能用于臨床需專門儀器基因槍很有效需專門儀器電穿孔適用于懸浮細(xì)胞需專門儀器顯微注射很有效技術(shù)困難化學(xué)方法磷酸鈣共沉淀法簡(jiǎn)單不適合懸浮細(xì)胞脂質(zhì)體法簡(jiǎn)單，很有效不適合懸浮細(xì)胞二乙銨乙基葡聚糖簡(jiǎn)單僅用于瞬時(shí)表達(dá)生物學(xué)方法反轉(zhuǎn)錄病毒法很有效宿主范圍限制原生質(zhì)體融合法適合懸浮細(xì)胞結(jié)果不穩(wěn)定（1）光穿孔法光穿孔法（optoporation）是利用激光產(chǎn)生的熱量，使細(xì)胞壁產(chǎn)生孔洞，將外源物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞。（2）沖擊波法沖擊波法（shockwavepermeabilization）是利用細(xì)胞受沖擊后細(xì)胞膜通透性瞬時(shí)增加，使外源基因?qū)爰?xì)胞。（3）基因槍法基因槍（genegun）法又叫微粒轟擊法、生物發(fā)射技術(shù)或高速微粒子發(fā)射技術(shù)。通過(guò)提供給包裹有DNA的微小金顆粒(或鎢粉)很高的初速度，使其穿透植物細(xì)胞壁而達(dá)到轉(zhuǎn)移外源質(zhì)粒子DNA的目的。（4）電穿孔法電穿孔(Electroporation)是指在高壓脈沖的作用下使細(xì)胞膜上出現(xiàn)微小的孔洞，從而導(dǎo)致不同細(xì)胞之間的原生質(zhì)膜發(fā)生融合作用的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。（5）磷酸鈣轉(zhuǎn)染法磷酸鈣轉(zhuǎn)染法（calciumphosphateco-precipitation）是把含外源基因的質(zhì)粒或已克隆化的基因作為轉(zhuǎn)染物，與磷酸鈣轉(zhuǎn)染液混合，加入到宿主細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境中，在磷酸鈣轉(zhuǎn)染液的媒介下能使轉(zhuǎn)染的DNA被整合到受體細(xì)胞的基因組中。（6）二乙銨乙基葡聚糖介導(dǎo)法該方法是帶正電的二乙銨乙基葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。（7）脂質(zhì)體法脂質(zhì)體（liposomeencapsulation）是由天然脂類和類固醇組成的微球，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可能的機(jī)理是陽(yáng)離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電的基因依靠靜電作用形成脂質(zhì)體基因復(fù)合物，該復(fù)合物因陽(yáng)離子脂質(zhì)體的過(guò)剩正電荷而帶正電，借助靜電作用吸附于帶負(fù)電的細(xì)胞表面，再通過(guò)與細(xì)胞膜融合或細(xì)胞內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，脂質(zhì)體基因復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中可能進(jìn)一步傳遞到細(xì)胞核內(nèi)釋放基因，并在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)。

（8）抗體轉(zhuǎn)染法利用抗體作為載體，介導(dǎo)基因進(jìn)入表達(dá)特定表面抗原細(xì)胞的方法為抗體轉(zhuǎn)染（antifection）。（9）其他其他有超聲波法，它的生物學(xué)效應(yīng)是空化作用，超聲過(guò)程中形成的真空氣旋在塌縮時(shí)產(chǎn)生局部高溫、高壓使氣泡周圍的細(xì)胞受到影響，細(xì)胞膜發(fā)生可逆的通透性變化。其他外源DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法還有，微注射法（microinjection）、原生質(zhì)體融合法（protoplastfusion）和病毒感染法（viralinfection）等。2哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移的遺傳選擇標(biāo)記（1）胸苷激酶基因（tk）選擇系統(tǒng)胸苷激酶(thymidinekinase)是核苷酸合成代謝途徑中的一種酶，能將胸苷轉(zhuǎn)換成為胸苷-磷酸。

在胸苷激酶基因選擇系統(tǒng)中，必須用tk表型缺陷型(tk-)細(xì)胞株作為宿主細(xì)胞。由于選擇tk+細(xì)胞的培養(yǎng)基含有次黃嘌呤(hupoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(thymidine)，所以叫做HAT選擇法。其選擇原理為：如果用葉酸的類似物氨基蝶呤(A)處理細(xì)胞，二氫葉酸還原酶被抑制，不能使二氫葉酸還原成四氫葉酸，其結(jié)果是培養(yǎng)基中的四氫葉酸因得不到補(bǔ)充而逐漸耗盡，于是從dUMP合成TTP以及dATP和dCTP的合成過(guò)程均被阻斷。次黃嘌呤是dATP和dACP補(bǔ)救合成途徑的一種底物，培養(yǎng)基中含有這種物質(zhì)時(shí)，細(xì)胞就能越過(guò)氨基蝶呤的抑制作用，利用補(bǔ)救途徑繼續(xù)合成出這些核苷酸。

（2）二氫葉酸還原酶基因(dhfr)選擇系統(tǒng)

DHFR-MTX高效表達(dá)系統(tǒng)外源基因dhfr轉(zhuǎn)染dhfr-細(xì)胞系單克隆培養(yǎng)轉(zhuǎn)移0.05mMMTX(氨甲喋呤)培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移5mMMTX0.25mMMTX培養(yǎng)單克隆外源基因擴(kuò)增至100拷貝（3）新霉素抗性選擇系統(tǒng)新霉素是細(xì)菌抗生素，它可以干擾原核生物的核糖體，使其蛋白質(zhì)合成不能正常進(jìn)行，新霉素的一種類似物G418(geneticin)對(duì)真核細(xì)胞和原核細(xì)胞均有毒性。細(xì)菌的新霉素抗性基因(neo)能在真核細(xì)胞中表達(dá)，當(dāng)neo基因與能有效轉(zhuǎn)錄的真核DNA序列連鎖時(shí)就能獲得有效的表達(dá)。Neo基因編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，這種酶能使G418失活。所以，當(dāng)細(xì)胞表達(dá)了這種neo抗性基因后，就會(huì)在含G418的選擇培養(yǎng)基中存活，這種選擇系統(tǒng)適用于所有的細(xì)胞類型。第二節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（技術(shù)）是以動(dòng)物個(gè)體作為基因受體的基因表達(dá)技術(shù)。目的基因?qū)雱?dòng)物體之后，其行為和表達(dá)調(diào)控與導(dǎo)入離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞系有很大差別。所以，即使單純出于研究目的，動(dòng)物細(xì)胞系也不能替代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念目前，對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還沒(méi)有一個(gè)簡(jiǎn)單而明確的定義。為了正確理解什么是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在這里我們只強(qiáng)調(diào)所有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物都是由于外源基因（包括同一物種的DNA）導(dǎo)入動(dòng)物的基因組而產(chǎn)生了可以遺傳的改變。這些可以遺傳的改變包括：外源基因片段至少整合到一條染色體的一個(gè)位點(diǎn)上；外源基因的插入使基因組中任何一個(gè)基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；外源基因的插入使染色體發(fā)生重排；外源基因?qū)肟梢猿志么嬖诘倪z傳實(shí)體等二、哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因操作表9-3幾種轉(zhuǎn)基因技術(shù)效果比較方法顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法精子介導(dǎo)法胚胎干細(xì)胞法體細(xì)胞核移植基因準(zhǔn)備易難易中等中等轉(zhuǎn)基因的大小無(wú)限定<10kb無(wú)限定無(wú)限定無(wú)限定定點(diǎn)整合不可能不可能不可能可能可能胚胎操作技巧要求高低低低高胎兒存活率低~中等高中等高低~中等胚胎存活率中等高中等中等低生后轉(zhuǎn)基因比例1~30%約100%約30%100%100%嵌合體發(fā)生頻率中等低低高無(wú)外源基因拷貝數(shù)高低低可選擇可選擇多位點(diǎn)插入低中等~高中等可控制低外源基因表達(dá)率50%可能出問(wèn)題50%高50%1.顯微注射法顯微注射法的具體做法是，在一臺(tái)倒置相差顯微鏡下，用一根直徑80~100μm的細(xì)玻璃管將胚胎固定，再用另一根直徑1~5μm的玻璃管刺入細(xì)胞原核，把DNA溶液直接注射到原核期胚胎的一個(gè)或兩個(gè)原核中。經(jīng)過(guò)顯微注射DNA的胚胎經(jīng)過(guò)1~3小時(shí)培養(yǎng)，證明未因顯微注射而發(fā)生裂解后，即可直接移植到代受體母畜的輸卵管中；也可以轉(zhuǎn)移到適當(dāng)培養(yǎng)液中，讓它們繼續(xù)發(fā)育到桑椹胚或囊胚階段，然后再進(jìn)行胚胎移植。

供體超排處理IVF產(chǎn)生胚胎重組基因DNA制備注射用DNA制備原核胚胎收集原核顯現(xiàn)技術(shù)受體同期化處理注射后胚胎暫培養(yǎng)DNA顯微注射胚胎移植實(shí)驗(yàn)后代產(chǎn)出基因純合試驗(yàn)基因整合檢測(cè)生產(chǎn)大量F1動(dòng)物動(dòng)物健康監(jiān)測(cè)原代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因表達(dá)檢測(cè)建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物家系建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物群體2.利用體細(xì)胞核移植制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物核移植(nucleartransfer，NT)通常是指將外源性細(xì)胞核作為供體轉(zhuǎn)入到去核卵母細(xì)胞中，細(xì)胞核發(fā)生基因程序重排而獲得多能性，開(kāi)始新的胚胎發(fā)育。3.胚胎干細(xì)胞法

4.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法先將外源基因克隆到轉(zhuǎn)移載體中，將克隆好的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞中形成有感染活性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，再去感染生殖細(xì)胞、早期胚胎或顯微注射受精卵。

5.精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移1989年，Lavitrano等人首次報(bào)道使用小鼠附睪精子攜帶外源DNA受精，生產(chǎn)出表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。從1987年到1998年，用精子介導(dǎo)法生產(chǎn)出許多轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，表明精子介導(dǎo)是一種有用的轉(zhuǎn)基因方法。但是精子介導(dǎo)法目前尚未弄清楚其真正的機(jī)理，使精子攜帶DNA的條件難以掌握，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不很穩(wěn)定，需要進(jìn)一步研究。三、外源基因的整合與表達(dá)1.外源基因的整合（1）外源基因整合的機(jī)制（2）專一位點(diǎn)重組2外源基因的表達(dá)（1）導(dǎo)入大片段酵母人工染色體(YAC)載體是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型載體，可插入長(zhǎng)達(dá)200-500kb的外源DNA。利用其導(dǎo)入外源基因在整合時(shí)不存在位置效應(yīng)，因?yàn)閅AC載體的大容量能保證巨大基因的完整性，保證所有順式作用因子的完整性。因此目的基因上下游的側(cè)翼序列可以消除或減弱基因整合后的“位置效應(yīng)”而引起緩沖區(qū)域的作用，從而提高外源基因的表達(dá)水平

（2）添加基質(zhì)附著區(qū)基質(zhì)附著區(qū)(MatrixAttachmentRegion，MAR)又稱核骨架附著區(qū)(ScaffoldAttachmentRegion，SAR)，其基本功能是將染色質(zhì)的環(huán)狀域附著到稱為核基質(zhì)的蛋白質(zhì)支架上，構(gòu)成基因組中各個(gè)功能域的邊界，相當(dāng)于基因組中的“標(biāo)點(diǎn)符號(hào)”。已有的研究表明，MAR與外源基因構(gòu)成的功能域?qū)爰?xì)胞后，在核內(nèi)游離狀態(tài)下(即整合前)，MAR會(huì)抑制所連接基因的表達(dá)，但在整合狀態(tài)下，MAR可以使外源基因克服位置效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，且不受MA