微衛(wèi)星dna多態(tài)性在斑馬魚遺傳監(jiān)測中的應用

微衛(wèi)星dna多態(tài)性在斑馬魚遺傳監(jiān)測中的應用

本馬登是一種新興的動物，在遺傳發(fā)展研究方面具有獨特的優(yōu)勢。目前國內外常用的斑馬魚品系個體在形態(tài)、大小上十分相似,不易區(qū)分,同時又缺乏可檢測的生物學標記。因此,在日常實驗中很容易造成品系之間的污染。而在醫(yī)學生物研究中,實驗動物的質量對實驗結果的可比性、重復性和準確性有著重要影響。實驗動物遺傳監(jiān)測是評定和保證實驗動物質量的一項常規(guī)工作。根據(jù)實驗動物標準要求,近交系是指至少經(jīng)過20代以上連續(xù)全同胞或親子交配,品系所有個體均可追溯到起源于第20代或以后代數(shù)的一對共同祖先的動物群。在近交系內個體遺傳差異很小,絕大部分基因座位點為純合,可用于各種需要遺傳背景明確的實驗。目前國際實驗室常用野生型斑馬魚品系已經(jīng)建立并保存了其近交系(見附表1)。大部分實驗均要求用斑馬魚使用各種野生型和突變型或轉基因的品系,它們均屬于近交系?，F(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展,使得直接利用DNA分子中的核苷酸序列的變異進行遺傳監(jiān)測成為可能,其中微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA),以其信息含量高、分布廣泛、高度多態(tài)性、易于交流、測定快捷等特點,有著廣闊的應用前景。本實驗參考兩個斑馬魚信息資源中心:ZFIN(斑馬魚信息網(wǎng)絡,ZebrafishInformationNetworks,現(xiàn)在改稱斑馬魚模式生物數(shù)據(jù)庫,TheZebrafishModelOrganismDatabase)。ZFIN提供了有關斑馬魚的基因、基因組、各類克隆、各種特異性試劑和到其他網(wǎng)絡資源的鏈接等,是有關斑馬魚的分子生物學、遺傳學、胚胎學和解剖學、發(fā)育生物學等學科信息的網(wǎng)絡中心。網(wǎng)站由俄勒岡大學維持。國際斑馬魚資源中心(TheZebrafishInternationalResourceCenter,ZIRC)是同為俄勒岡大學維持的和ZFIN有著密切聯(lián)系的另一個資源中心,為世界的斑馬魚研究者提供各種品系的保管、育種已經(jīng)其他很多生理和病理試劑產(chǎn)品服務。應用成功地設計并篩選出了3對微衛(wèi)星引物序列用于斑馬魚品系的微衛(wèi)星標記鑒定,PCR實驗結果證明它們可用于區(qū)分常用的AB、TU、WIK品系以及LF準品系。這一結果為實驗用斑馬魚常見品系的鑒定提供了一個簡單易行的參考標準,這一標準使得在品系背景清楚的基礎上取得的研究結果能體現(xiàn)出更高的特異性、可重復性和可信度。1材料和方法1.1斑馬魚系的組成和特性斑馬魚品系:AB、TU、WIK、長鰭(LF,由北京大學斑馬魚實驗室篩選)。AB品系是現(xiàn)階段使用最廣的野生型斑馬魚品系。最初由俄勒岡大學Streisinger實驗室培育,現(xiàn)由ZIRC保種。Tübingen(或Tuebingen,TU)品系來源于德國Tübingen城市的一個野生短鰭品種,通過篩選去除了其胚胎期致死突變,隨后被用于誘變和Sanger中心進行的斑馬魚基因組計劃測序。WIK品系相對TU品系存在相當多的遺傳多態(tài)性,原名WIK11。來源于在印度捕獲的野生品種,將其單對交配以產(chǎn)生亞系,并進行篩選,發(fā)現(xiàn)其中一個亞系WIK11的胚胎及幼魚致死性突變已減少了90%。長鰭(Longfin,LF,暫定名)是北京花鳥市場常見的一種觀賞用斑馬魚的野生型表型。它具有在外觀上與其他品系存在顯著差別的特點,在一些實驗中可作為直觀的分辨標準。北京大學斑馬魚實驗室曾引種了部分長鰭表型斑馬魚,不過目前自交代數(shù)尚不夠構成品系的標準,有待進一步純化。1.2pcr檢測pcr擴增根據(jù)從基因組注釋數(shù)據(jù)庫中篩選得到的微衛(wèi)星序列,通過大量的PCR實驗,在不同染色體上篩選的3個微衛(wèi)星位點為:z3782、z4299、z24244。并設計選用z3782、z4299、z24244三對引物進行PCR擴增(表1)。1.3基因組dna濃度檢測分別從AB、TU、WIK、LF挑選近交系斑馬魚4條,剪取成魚尾部提取基因組,并使用分光光度計測量基因組DNA的濃度(OD260/OD280為1.3～1.4)。取出部分基因組DNA溶液稀釋到10ng/μL作為PCR擴增模板。1.4引物體系及引物合成體系經(jīng)過大量PCR實驗的篩選,最后選用微衛(wèi)星標記z3782、z4299、z24244這三對引物對AB、TU、LF、WIK4個不同品系的基因組進行PCR擴增:每個PCR體系為20μL,其中2×MasterMix(TIANGEN公司)10μL,上游引物、下游引物各1μL(10ng/μL),基因組DNA8μL(10ng/μL)。使用TouchDownPCR以降低非特異性擴增,反應條件為:95℃預變性3min,95℃變性20s,65℃～51℃復性(每循環(huán)降1℃)20s,72℃延伸40s,以上三個步驟15個循環(huán)擴增,95℃變性20s,50℃復性20s,72℃延伸40s,25個循環(huán)擴增,最后一個循環(huán)后置72℃繼續(xù)延伸6min,擴增產(chǎn)物4℃保存。1.5瓊脂糖凝膠電泳實驗確定以下電泳條件:配制3%(對于z4299)或4%(對于z3782、z24244)的瓊脂糖凝膠,使用50bpLadder(對于z4299)或20bpLadder(對于z3782、z24244)作為分子量標準,在低電流(100～130mA)的條件下電泳30～40min以分離擴增條帶。2tu,lf,400p三對微衛(wèi)星引物在四種斑馬魚品系之間具有顯著的多態(tài)性(圖1～2)。圖1～2表明,z4299、z3782、z24244三對引物可以把我們使用的AB、TU、WIK、LF四種近交系明顯區(qū)分開。PCR目的條帶的具體大小匯總見表2。引物z4299對四種近交系斑馬魚擴增的條帶數(shù)量和大小各不相同:AB三條帶(230bp,260bp,370bp);TU兩條帶(230bp,260bp);LF兩條帶(260bp,280bp)幾乎重合為一條帶;WIK三條帶(190bp,260bp,300bp)。其中AB與TU二者的差別就差一條帶370bp,LF幾乎重合為一條帶也比較好區(qū)分,WIK的三條帶與AB的三條帶區(qū)分在大小上。引物z3782對四種近交系斑馬魚擴增的條帶數(shù)量或大小各不相同:其中只有AB擴增出來兩條帶(90bp,200bp);TU,LF,WIK都只有一條帶,但大小不同,分別為170bp,120bp,90bp,三者相互區(qū)分時要用20bpLadder作為對照。引物z24244對四種近交系斑馬魚擴增的條帶數(shù)量或大小各不相同:AB兩條帶(170bp,180bp),TU兩條帶(160bp,180bp),LF一條帶160bp,WIK三條帶(170bp,190bp,210bp)。用z24244引物區(qū)分這四種近交系斑馬魚必需要用20bpLadder作為對照。3微衛(wèi)星多態(tài)性dna檢測微衛(wèi)星DNA又稱STR(shorttandomrepeat),是廣泛存在于原核、真核生物基因組中,核心序列為2～6bp的串聯(lián)重復序列,重復次數(shù)從幾次到數(shù)十次,從而形成了微衛(wèi)星DNA的高度多態(tài)性。利用微衛(wèi)星DNA側翼序列設計引物進行PCR擴增,由于重復次數(shù)不同形成片段長度不同,經(jīng)電泳分離、銀染后,就可表現(xiàn)不同的電泳帶型,從而判斷是否發(fā)生遺傳污染或遺傳變異。微衛(wèi)星DNA在不同品系間的多態(tài)性,可用于不同品系間的鑒別。目前應用于魚類遺傳檢測的標記有:形態(tài)標記、細胞遺傳標記、生化標記、分子遺傳標記等。國標所規(guī)定的遺傳檢測方法是生化標記分析法,這一方法是檢測同工酶或異構蛋白的變化來推測相應的基因變化,存在著準確度及靈敏度低、檢測位點及反映遺傳概貌有限等弊端。而微衛(wèi)星標記在基因組中廣泛分布,等位性變異豐富,檢測手段簡便,穩(wěn)定可靠,是遺傳背景分析、群體遺傳結構和遺傳純度分析的有效手段。本實驗初步運用微衛(wèi)星多態(tài)性DNA來鑒別4種不同近交系的斑馬魚。微衛(wèi)星DNA法是在微衛(wèi)星DNA序列旁邊的保守單拷貝序列設計引物,以獲得微衛(wèi)星DNA位點多態(tài)性。本實驗基于PCR技術的方法均有操作簡單、樣品需求小、分辨率高、污染低(相對同位素成像)、成本低等特點;就實驗結果而言,斑馬魚基因組DNA相對穩(wěn)定,我們用三對微衛(wèi)星引物進行擴增