硝酸咪康唑散體外經(jīng)皮透過(guò)安全性評(píng)價(jià)

硝酸咪康唑散體外經(jīng)皮透過(guò)安全性評(píng)價(jià)

亞硝酸鹽咪康唑是一種抗真菌藥物。當(dāng)4mg/l濃度時(shí)，大多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。芽生菌和組織漿菌非常敏感，隱菌、桿菌和空面菌也對(duì)這種藥物敏感。本試驗(yàn)通過(guò)離體透過(guò)性試驗(yàn),以小型豬(巴馬香豬)全皮皮膚為模型,考察硝酸咪康唑散體外經(jīng)皮透過(guò)性。以市售產(chǎn)品(硝酸咪康唑散,西安楊森制藥有限公司)為對(duì)照,評(píng)價(jià)沈陽(yáng)福寧藥業(yè)有限公司制備的硝酸咪康唑散經(jīng)皮透過(guò)性,以此對(duì)比評(píng)估藥物透過(guò)安全性的大小,現(xiàn)報(bào)告如下。1材料和機(jī)器1.1藥物、試劑和儀器硝酸咪康唑?qū)φ掌?中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):100213—200204,含量:99.9%);對(duì)照市售硝酸咪康唑散(西安楊森制藥有限公司,批號(hào):080411630);受試硝酸咪康唑散(沈陽(yáng)福寧藥業(yè)有限公司,批號(hào):20081101);0.9%氯化鈉注射液(黑龍江七臺(tái)河制藥廠,批號(hào):081225101);其余試劑為市售分析純。小型豬(巴馬香豬,雄性),由重慶宗申醫(yī)達(dá)生物技術(shù)研發(fā)有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(渝)20020002。1.2nz立式擴(kuò)散池透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(TK-12B型),上海鎧凱科技貿(mào)易有限公司改良的Franz立式擴(kuò)散池(有效透過(guò)面積3.14cm2,接受池體積:7mL,上海鎧凱科技貿(mào)易有限公司)高效液相色譜法(HPLC)色譜儀(10AD),日本島津HPLC工作站,LC-Solutionlite,日本島津。2方法和結(jié)果2.1脂肪組織的制備將小型豬處死,機(jī)械法剪毛,剝?nèi)∑つw,切皮刀除去多余的脂肪組織,用0.9%氯化鈉注射液洗干凈,放置冰箱(-70℃中)冷藏,備用。2.2流動(dòng)相:乙腈甲醇5%醋酸銨/3.色譜柱:Chromatore×C18(150mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈∶甲醇∶5%醋酸銨(42.5∶42.5∶15);流速:1mL/min;柱溫:25℃;檢則波長(zhǎng):230nm;進(jìn)樣量:20μL。2.3待液時(shí)需大量加入共添加量樣取離體小型豬皮膚,按透皮試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn),但是給藥池中不加藥物,以0.9%氯化鈉注射液為接受液時(shí)取試驗(yàn)2、10h的接受液;以丙二醇∶0.9%氯化鈉注射液(1∶2)為接受液時(shí)取試驗(yàn)1、10h的接受液,過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定。硝酸咪康唑保留時(shí)間為8.02min,而空白樣品溶液在此保留時(shí)間無(wú)吸收,說(shuō)明輔料不干擾硝酸咪康唑測(cè)定。硝酸咪康唑溶液柱效為5702,符合要求。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢測(cè)限精密稱取硝酸咪康唑?qū)φ掌?.0252g,加甲醇溶解稀釋成濃度為10μg/mL的溶液,逐步稀釋,進(jìn)樣測(cè)定,選取HPLC圖譜基線噪音3倍者作為最低檢測(cè)限,進(jìn)樣濃度為:0.004μg/mL,最低檢測(cè)限=0.004μg/mL×20μL=8×10-5μg。2.5線性關(guān)系的考察精密稱取硝酸咪康唑?qū)φ掌?.0252g,加甲醇溶解稀釋成濃度為10μg/mL的溶液,用甲醇逐步稀釋配制成0.2、0.5、1、2.5、5、10μg/mL的溶液。每一濃度進(jìn)樣2次進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品的峰面積(A)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程A=37088C-252.33(r=0.9999)。說(shuō)明,硝酸咪康唑在0.2～10μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。濃度大于該范圍的樣品用接收介質(zhì)稀釋后,進(jìn)樣測(cè)定。2.6加樣回收率試驗(yàn)用甲醇稀釋配制0.2、5、10μg/mL硝酸咪康唑溶液,按色譜條件各連續(xù)進(jìn)樣3次,用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥量,求算回收率,回收率在98%～102%。見(jiàn)表1。2.7精密度測(cè)試回收率測(cè)定所用樣品溶液,每份重復(fù)測(cè)定3次,計(jì)算高、中、低不同濃度的精密度,結(jié)果見(jiàn)表2。RSD<2%,顯示精密度良好。2.8進(jìn)樣測(cè)定條件取經(jīng)皮透過(guò)性試驗(yàn)樣品溶液,于室溫下放置,并于0、2、3、4、5h按以上色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,峰面積(A)分別為429144、418578、413126、401242、406312,RSD2.6%。結(jié)果顯示,硝酸咪康唑峰面積無(wú)明顯變化,表明樣品溶液在5h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.9體外經(jīng)皮擴(kuò)散試驗(yàn)2.9.1未增溶劑中的溶解度的確定在體外經(jīng)皮試驗(yàn)中,文獻(xiàn)中最常用的接受液是0.9%氯化鈉注射液和磷酸鹽緩沖液(PBS),理想的接受介質(zhì)應(yīng)當(dāng)可以準(zhǔn)確模擬被測(cè)化合物的體內(nèi)經(jīng)皮吸收條件。一般來(lái)說(shuō),在接受液中藥物的濃度不能超過(guò)其飽和溶解度的10%(即應(yīng)該滿足漏槽條件),接受液濃度過(guò)高能導(dǎo)致吸收速率降低,進(jìn)而導(dǎo)致過(guò)低估計(jì)了其在體吸收。一般認(rèn)為一個(gè)化合物在某水性溶液中的溶解度如果低于10μg/mL,則不能用該溶液作接受液,有必要在接受介質(zhì)中加入增溶劑。因?yàn)橄跛徇淇颠蚴请y溶性藥物,為此我們首先考察藥物在0.9%氯化鈉注射液以及丙二醇∶0.9%氯化鈉注射液(1∶2)混合液中的溶解度,以確定接受介質(zhì)。稱取硝酸咪康唑原料藥約1g,至30mL磨口三角瓶中,加入接受液25mL,使溶液中始終保持有固體藥物存在,將此溶液置于37℃恒溫水浴中,100r/min磁力攪拌,定時(shí)取樣1mL,0.45μm微孔濾膜濾過(guò),棄去初濾液,取續(xù)濾液,進(jìn)樣20μL用HPLC測(cè)定含量,按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算硝酸咪康唑的濃度,超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的樣品,用各自接受介質(zhì)稀釋后進(jìn)樣測(cè)定。每種介質(zhì),平行做2份試驗(yàn)。分別測(cè)定1、2、3、5h的溶解度,以確定所選的介質(zhì)是否可以滿足漏槽條件。見(jiàn)表3,4。從溶解度的測(cè)定結(jié)果可以看出,硝酸咪康唑在0.9%氯化鈉注射液中的溶解度在80μg/mL左右,而丙二醇∶0.9%氯化鈉注射液(1∶2)混合液中可以超過(guò)1mg/mL,均>10μg/mL,所以我們選用這2種介質(zhì)作為透皮吸收的接受液,分別考察藥物的經(jīng)皮透過(guò)性。2.9.2透皮吸收法藥物濃度法采用改良的Franz立式擴(kuò)散池進(jìn)行試驗(yàn),本法是目前文獻(xiàn)中較常見(jiàn)的局部用制劑的體外透過(guò)性研究方法,一般認(rèn)為是一種簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好的試驗(yàn)方法。擴(kuò)散池由給藥池和接收池組成,將皮膚固定在供給池與接收池之間,將角質(zhì)層面向給藥池一側(cè),供給池中加入被測(cè)制劑(硝酸咪康唑散0.5g,以方便散劑粉末完全覆蓋給藥池中的試驗(yàn)用皮膚表面,相當(dāng)于硝酸咪康唑10mg),輕輕晃動(dòng),使散劑均勻分布于皮膚上。接收池中加入7mL的接受液,供給池底部凹槽中放入磁力攪拌子,攪拌速度100r/min,溫度(37.0±0.5)℃。開(kāi)始試驗(yàn)后,于1、2、3、4、6、8、10h定時(shí)取樣,每次吸取3mL接受液,隨即補(bǔ)等量的接受液,過(guò)濾后利用HPLC測(cè)定藥物濃度。按分析方法項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)得峰面積后,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度,再根據(jù)接受池液體積和有效擴(kuò)散面積,按下面的公式計(jì)算單位面積(cm2)的累積透皮量(Qn)。Qn=(CnV+∑i=1n?1CiVi)/SQn=(CnV+∑i=1n-1CiVi)/S式中,Ci為第i點(diǎn)測(cè)得的藥物濃度(μg/mL);V為接受池液的總體積(7.0mL);Vi為每次取樣的體積(3.0mL);S為滲透面積(3.14cm2)。受試硝酸咪康唑散和對(duì)照硝酸咪康唑散,分別以0.9%氯化鈉注射液、丙二醇∶0.9%氯化鈉注射液(1∶2)混合液為接受液的經(jīng)皮透過(guò)性測(cè)定?？梢钥闯?在該試驗(yàn)條件下,無(wú)論是受試樣品還是對(duì)照樣品,均不能透過(guò)小型豬的離體皮膚,在經(jīng)皮透過(guò)性上沒(méi)有差異。因此可以推斷兩者在藥物透過(guò)安全性大小上具有一致性。3散劑的溶解度透皮實(shí)驗(yàn)中,接受介質(zhì)的確定是較關(guān)鍵的一步。在接受液中,藥物濃度應(yīng)滿足漏槽條件。由于硝酸咪康唑是難溶藥物,本實(shí)驗(yàn)首先考察藥物在0.9%氯化鈉注射液、丙二醇∶0.9%氯化鈉注射液(1∶