dna重組技術(shù)在動物科學(xué)中的應(yīng)用

dna重組技術(shù)在動物科學(xué)中的應(yīng)用

dna重組技術(shù)是中醫(yī)學(xué)的核心。它規(guī)定，在外部條件下，不同生物的基因被移植到“切割”、“融合”和“重組”中，重建遺傳物質(zhì)，并通過載體轉(zhuǎn)移到受細(xì)胞。所需的基因因移植到受細(xì)胞。dns重組技術(shù)包括三種技術(shù)方法：酸性分子混合技術(shù)、pcr反應(yīng)、內(nèi)切酶限制等。在本文中，我們介紹了這一技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)中的應(yīng)用。重組DNA技術(shù)屬于遺傳工程分子水平的遺傳操作,是一種按照人的意志定向改變生物遺傳性狀的技術(shù)。廣義的遺傳工程包括細(xì)胞水平的遺傳操作(稱為細(xì)胞工程)和分子水平的遺傳操作(稱為重組DNA技術(shù))。狹義的遺傳工程就是重組DNA技術(shù),重組DNA技術(shù)是在體外重新組合DNA分子(脫氧核糖核酸),并使其在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中增殖的遺傳操作,這種操作可將特定的基因組合到載體上,并使其在受體細(xì)胞中增殖和表達(dá)。因此,它不受親緣關(guān)系限制,為分子遺傳學(xué)和育種學(xué)以及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究開辟了嶄新途徑。1dns技術(shù)的基本步驟1.1dna的形成和合成基因是含特定遺傳信息的核苷酸序列,是遺傳物質(zhì)的最小功能單位,基因可被分離出來。例如,從大腸桿菌中可將乳糖發(fā)酵基因分離出來。先利用兩種有差異的親緣關(guān)系相近的溫和噬菌體分別感染兩類大腸桿菌,噬菌體的DNA可與大腸桿菌的染色體發(fā)生整合。整合位置恰好都在含乳糖發(fā)酵基因DNA片段,但方向相反,整合到大腸桿菌中的噬菌體DNA得到復(fù)制,用紫外線刺激大腸桿菌,使帶乳糖發(fā)酵基因的噬菌體,DNA可以從大腸桿菌染色體中脫出,形成帶乳糖發(fā)酵基因的噬菌體。兩種親緣關(guān)系相近的溫和噬菌體,通過加熱使其DNA片段雙鏈分開,形成單鏈DNA。進(jìn)一步將兩種噬菌體DNA單鏈混合在一起,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則,互補(bǔ)的堿基配對成雙鏈,不能配對的為單鏈。然后,用外切酶把單鏈DNA切斷,單鏈被分解,保留了雙鏈乳糖發(fā)酵基因?；虻暮铣芍饕谢瘜W(xué)合成和酶促合成兩種方法。(1)化學(xué)合成:例如胰島素,已知胰島素分子由51個氨基酸組成,它可分為A鏈和B鏈,A鏈由21個氨基酸組成,B鏈由30個氨基酸組成,可用遺傳密碼推導(dǎo)出決定A、B鏈DNA上的堿基對排列進(jìn)行入工合成。(2)酶促合成是利用限制性內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄酶獲得DNA基因片段的方法。目前已從微生物中提純出600多種限制性內(nèi)切酶,其中常用的只有數(shù)十種,用這種酶可獲得目的基因。真核生物,特別是高等動物和植物的結(jié)構(gòu)基因是不連續(xù)的“間斷基因”,即DNA可以在內(nèi)切酶作用下被切斷,無編碼意義的內(nèi)含子被酶分解;而有編碼意義的外顯子由連接酶連接并轉(zhuǎn)錄為mRNA,可利用逆轉(zhuǎn)錄酶得到有關(guān)的cDNA基因片段。這種基因片段,是不含內(nèi)含子而只有外顯子的cDNA。例如兔血紅蛋白基因提取,就是利用逆轉(zhuǎn)錄酶作用于mRNA取得相應(yīng)cDNA。用上述方法也可以得到胰島素、絲心蛋白等基因。1.2病毒、沖突體和質(zhì)粒運(yùn)載體的作用是將分離或合成的基因?qū)爰?xì)胞或能轉(zhuǎn)移染色體上的DNA片段,所以必須能自由出入細(xì)胞,常用的載體有SV40病毒、溫和噬菌體和質(zhì)粒等,但最常用的是質(zhì)粒。質(zhì)粒是染色體以外能夠自主復(fù)制的遺傳單元,是由雙鏈DNA分子組成,呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)?？梢杂坞x于細(xì)胞漿中,也可與染色體整合在一起,沒有蛋白質(zhì)外套,是裸露的DNA分子,比染色體小,只帶數(shù)個或數(shù)10個基因,最大的也只有大約100個基因,上面有一個位點(diǎn)稱為原點(diǎn),可以攜帶染色體轉(zhuǎn)移。1.3無性繁殖系重組dna克隆化用溶菌酶裂解菌細(xì)胞分離出質(zhì)粒。用內(nèi)切酶處理質(zhì)粒,使其DNA在一定位置上斷裂,并在斷裂口出現(xiàn)粘性末端。用同樣的內(nèi)切酶處理分離出的目的基因的DNA,使之具有相同的粘性末端與質(zhì)粒粘性末端相連接,形成重組DNA穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。將重組DNA導(dǎo)入不含質(zhì)粒的細(xì)菌,即受體細(xì)菌中,例如大腸桿菌中,目的基因能隨質(zhì)粒復(fù)制而復(fù)制,并隨細(xì)菌的分裂而擴(kuò)增,形成這一基因的無性繁殖系重組DNA克隆化。1.4重組DNA的表達(dá)在加入適量四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基上,例如抗四環(huán)素基因的質(zhì)粒十胰島素基因的重組DNA,可以在大腸桿菌中復(fù)制,擴(kuò)增產(chǎn)生大量胰島素。2通過氨基酸分子雜交技術(shù)和pcr反應(yīng)應(yīng)用動物科學(xué)2.1核酸分子雜交檢測傳統(tǒng)的方法多是以免疫學(xué)方法檢測病原體抗原及其在動物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體,或者使用不同的方法分離培養(yǎng)微生物,有時存在靈敏度特異性低及速度慢等問題,有的病原體侵入機(jī)體后需潛伏一定時間后才出現(xiàn)抗體,用免疫學(xué)方法很難及時檢測出來,一些持續(xù)感染卻不能積極產(chǎn)生病毒顆粒的病毒,通過檢測抗原的方法,難以檢測到病毒,有的病毒的血清學(xué)檢測只能確定是否接觸過這種病毒,但不能肯定是否存在現(xiàn)行感染。核酸分子雜交技術(shù)可克服以上不足,并可用于動物群體的大量檢測工作,其靈敏度很高,尤其是PCR反應(yīng),有時甚至存在一個病原體即可檢出,其取材范圍廣,可從動物的血、尿、糞便、分泌物、體液、涂片、活檢或尸解標(biāo)本中直接檢測,也可應(yīng)用組織培養(yǎng)或細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本、組織切片檢測。同時,目前已有大量的基因探針、寡核苷酸引物可供檢測使用,運(yùn)用這些探針、引物進(jìn)行核酸分子雜交、PCR反應(yīng),可以對大量的病原體(病毒、細(xì)菌、寄生蟲)進(jìn)行檢測。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),在實(shí)驗(yàn)動物有關(guān)病原體方面,已進(jìn)行了EB病毒、狂犬病毒、流行性出血熱病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、輪狀病毒、細(xì)小病毒、腺病毒、慢病毒、鼠沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎支原體、弓形體等的應(yīng)用研究。YasukoK等對入工感染鼠肝炎病毒MHV-JHM小鼠的組織進(jìn)行了PCR檢測,小鼠腹腔接種病毒后僅ld,即可從感染鼠的肝及腦組織中擴(kuò)增出其病毒核酸,而以ELISA法進(jìn)行MHV抗體的檢測,在接種后6d仍呈陰性,表明PCR是實(shí)驗(yàn)動物鼠肝炎病毒檢測的敏感方法。2.2dna指紋分析法在生物進(jìn)化過程中,由于各種原因引起DNA內(nèi)核苷酸排列順序改變,當(dāng)這種改變涉及到限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)時,利用限制性內(nèi)切酶可將DNA切割成不同長度的限制性片段。這些具有不同長度的限制性片段類型在人或動物群體中所呈現(xiàn)的多態(tài)分布現(xiàn)象就稱為限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。RFLP在實(shí)驗(yàn)動物遺傳孕研究中具有重要作用,可以據(jù)此繪制各品系動物的基因組限制性內(nèi)切酶圖譜,以研究各品系動物的起源、分化和血緣關(guān)系。史順娣和王昔舟等分別對KM小鼠及我國自行培育的三種近交系小鼠(TA1、TA2、615)的線粒體DNA(mtDNA)進(jìn)行了酶切電泳分析,其結(jié)果顯示KM、TA1、TA2、615與DBA/2,C67BL/6的mtDNA內(nèi)切酶圖譜一致,表明它們具有相同的起源,即起源于歐州的野鼠Musmusculusdomesticus。引入注目的是DNA指紋分析法的出現(xiàn)使得RFLP的原理在近郊系動物品系的遺傳學(xué)純度及遺傳學(xué)質(zhì)量檢測中得以應(yīng)用。1985年英國遺傳學(xué)家Jeffery等入在入體基因組DNA中發(fā)現(xiàn)了高度可變的小衛(wèi)星區(qū)域,這些小衛(wèi)星DNA的高可變區(qū)是由頭尾相連的串聯(lián)重復(fù)序列組成,其核心序列同源性很高,高可變區(qū)的一長度由于串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)不同而有很大的差別,這樣的重復(fù)序列被命名為VNTR(Variablenumberoftandemrepeat),串聯(lián)重復(fù)次數(shù)的不同,酶切割DNA的片段長度也不同,這些片斷經(jīng)小衛(wèi)星DNA探針進(jìn)行southern雜交后顯示出豐富的RFLP。同一個體的不同組織來源的DNA的譜帶完全一致,而不同個體之間(除非同卵雙生)譜帶都不相同,如同入的指紋具有高度個體特異性一樣。因此,這種southern雜交圖被稱為DNA指紋(fingerpint)。此項(xiàng)技術(shù)首先在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用于親子鑒定及罪犯的確認(rèn),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)小衛(wèi)星DNA串聯(lián)重復(fù)序列也存在于其它哺乳類動物基因組,且其核心順序高度同源,這就為在品系內(nèi)具有個體間基因型一致性的近交系動物遺傳純度檢測提供了理論依據(jù)。RbertJ.Russell等利用DNA指紋分析對近交系大、小鼠進(jìn)行了遺傳學(xué)檢測。其方法為從各品系動物的尾尖或肝提取DNA,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后,利用入源性的小衛(wèi)星DNA核心順序33.6作為探針,以Southern法進(jìn)行雜交,其結(jié)果12個近交系大鼠品系均有自己獨(dú)特的DNA指紋,而同一品系內(nèi)各個體的DNA指紋相同。經(jīng)生化標(biāo)志物檢測證實(shí)發(fā)生了遺傳污染的近交系大鼠Lou/IaP的DNA指紋呈現(xiàn)變異。小鼠近交系品系間也具有自己獨(dú)特的品系DNA指紋,一些同源近交系間的DNA指紋可相互區(qū)別,但C57BL/6與CBA/ca的雜交F1的DNA指紋不能與C57BL/6區(qū)別。通過生化標(biāo)志檢測未能檢測到疑為發(fā)生了遺傳污染的MRI/MP-lpr小鼠的遺傳變異,經(jīng)DNA指紋分析后清楚地證實(shí)了其遺傳污染。Tetsuokunieda等利用人肌紅蛋白小衛(wèi)星DNA核心序列(MYO)作為探針,對近交系大鼠進(jìn)行了DNA指紋分析,結(jié)果表明15個近交系大鼠品系間的DNA指紋完全不同,而同一品系內(nèi)不同個體的DNA指紋完全相同。來源于同一品系內(nèi)的兩個亞系的DNA指紋也相同,表明動物經(jīng)歷數(shù)代繁殖后,DNA指紋仍呈現(xiàn)相對穩(wěn)定。根據(jù)上述研究結(jié)果,研究者認(rèn)為DNA指紋分析是近交系動物遺傳學(xué)檢測的一種簡單、快速、有用的新型檢測方法,具有良好的應(yīng)用前景。3旋轉(zhuǎn)動物的研究基因轉(zhuǎn)移是用物理的、化學(xué)的、生物的手段將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之表達(dá)的一種技術(shù),它包括體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移及生殖細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移,后者即為轉(zhuǎn)基因動物的建立,故轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)是指那些在其基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合進(jìn)以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因,并能遺傳給后代的一類動物。轉(zhuǎn)基因動物建立的技術(shù)過程依次為。分離編碼某一目的產(chǎn)物的基因,或者分離對動物表型有作用的某一基因;制備DNA重組子使其能在選定的組織內(nèi)表達(dá),從而繞過正常存在于動物機(jī)體的代謝過程;將DNA重組子在體外轉(zhuǎn)移至一個剛剛受精的單細(xì)胞卵中(導(dǎo)入方法包括微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、精子載入法、電轉(zhuǎn)移法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法);經(jīng)處理的卵重新植入適當(dāng)?shù)氖荏w中;子代性狀的分析。轉(zhuǎn)基因動物的研究雖然只有10多年的歷史,但它取得的成就已舉世公認(rèn),并越來越受到重視,轉(zhuǎn)基因動物研究與不同學(xué)科的結(jié)合,開創(chuàng)了許多具有重大理論和應(yīng)用價值的研究方向,解決了一些其它技術(shù)所不能解決的問題。下面列舉幾個方面來闡述轉(zhuǎn)基因動物研究的意義及應(yīng)用情況:(1)基因表達(dá)與調(diào)控;轉(zhuǎn)基因動物為基因發(fā)育階段性表達(dá)和組織特異性表達(dá)提供了一個極好的實(shí)驗(yàn)體系,將不同的基因片段重組子注射入受精卵,研究其在轉(zhuǎn)基因動物中的整合表達(dá),對證實(shí)某些DNA序列的作用是非常有用的手段。(2)免疫學(xué)研究:利用轉(zhuǎn)入19基因小鼠制備入單抗,使我們在制備入單抗時,不受抗原免疫的限制:導(dǎo)入人MHC基因?yàn)檠芯康贗類和第II類組織相容性抗原的功能提供了新的手段。(3)人類疾病模型的建立:如轉(zhuǎn)入人Huntington舞蹈病基因的小鼠,可以產(chǎn)生舞蹈病;將BPV(DNA腫瘤病毒)導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因動物中誘發(fā)了皮膚癌;用癌基因建立的轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)腫瘤,致瘤性可轉(zhuǎn)遞給后代;用乙型肝炎病毒基因建立的轉(zhuǎn)基因小鼠組織中表達(dá)HBsAgmRNA;用HIV基因建立的轉(zhuǎn)基因小鼠可出現(xiàn)HIV抗體、HIVg120外膜蛋白及逆轉(zhuǎn)錄酶等。(4)動物優(yōu)良品種的培育:將優(yōu)良性狀的基因?qū)雱游锷诚?開辟了培育優(yōu)良動物新品種的新途徑。當(dāng)首次將生長激素基因?qū)胄∈?得到了比原來個體大幾倍的“超級小鼠”時,也許人們就認(rèn)識到轉(zhuǎn)基因動物在遺傳育種方面的劃時代約意義。目前已經(jīng)得到的轉(zhuǎn)基因動物除小鼠外,還有轉(zhuǎn)基因兔