糖尿病小鼠缺血誘導(dǎo)的骨髓內(nèi)皮祖細胞動員障礙

糖尿病小鼠缺血誘導(dǎo)的骨髓內(nèi)皮祖細胞動員障礙

糖尿病患者通常伴有高血壓、動脈粥樣硬化等血管并發(fā)癥。容易患心血管疾病，如致命心臟病、缺血性腦損傷和下肢動脈血栓形成，且缺氧后預(yù)后不好。其發(fā)病機制與糖尿病血管內(nèi)移植的改善和組織缺氧后的血管新生障礙密切相關(guān)。最近研究顯示,缺血組織的血管新生及側(cè)支形成不僅依賴于原位血管的芽生與重塑,骨髓起源的內(nèi)皮祖細胞(endothelialprogenitorcell,EPC)也積極參與了這一過程。受到內(nèi)源性缺血損傷或者外源性細胞因子、藥物的刺激后,骨髓中的干細胞和EPC能夠動員至外周血,進而參與內(nèi)皮修復(fù)及血管新生。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducedfactor,HIF)-1α介導(dǎo)的間充質(zhì)衍生因子(stromal-derivedgrowthfactor,SDF)-1α/血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)/蛋白激酶B(proteinkinaseB,Akt)/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)/基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)信號通路在EPC動員過程中發(fā)揮重要作用。研究也發(fā)現(xiàn)糖尿病患者與糖尿病動物循環(huán)中EPC數(shù)量減少,同時EPC參與反應(yīng)性血管新生等功能存在缺陷。以前我們利用后肢缺血模型發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠組織缺血后外周血早期EPC動員障礙,然而阻礙糖尿病動物骨髓EPC釋放至外周血的具體機制目前尚未明了。本研究的主要目的就是進一步探討糖尿病缺血誘導(dǎo)的骨髓EPC動員障礙是否與SDF-1α/VEGF/Akt/eNOS/MMP-9信號通路的活化受損有關(guān)。1材料和方法1.1實驗分組、模型建立及模型的建立8周齡C57BL/6小鼠(南京大學(xué)模式動物研究所)100只,體質(zhì)量(25.1±1.2)g,隨機分為糖尿病及非糖尿病兩組(每組n=50),參照文獻建立糖尿病模型。糖尿病組每日腹腔注射40mg/kg鏈脲霉素,連續(xù)5d,于末次注射3d后采用微量血糖儀測量血糖,此后每周監(jiān)測血糖以確定空腹血糖持續(xù)高于10mmol/L,低于此數(shù)值者剔除出糖尿病組。非糖尿病對照組腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。模型建成后于屏障系統(tǒng)百級獨立送排風(fēng)籠具飼養(yǎng)2月。實驗過程中有少量動物死亡,死因主要為術(shù)前或術(shù)后同籠小鼠咬傷、術(shù)中出血、血糖過高或體質(zhì)量過低小鼠術(shù)后衰竭等,糖尿病及非糖尿病對照每組存活38～40只。存活小鼠部分用于缺血術(shù)后血管造影、紅四氮唑染色試驗,或者因高血糖自發(fā)緩解、手術(shù)不合格及術(shù)后傷口哆開炎癥反應(yīng)等被剔除。最后兩組小鼠各有32只被納入各時間點實驗組(術(shù)前、術(shù)后3d各10只,術(shù)后1、7d各6只)。1.2術(shù)后行血管造影小鼠飼養(yǎng)2月后,參照文獻在立式手術(shù)顯微鏡下行左側(cè)股動脈高位結(jié)扎離斷術(shù)。術(shù)后行后肢血管造影可見右股動脈及其大分支顯影清晰,而左側(cè)未見大血管及其分支顯影。左后肢因股動脈及其大分支結(jié)扎離斷后組織缺血線粒體損傷,故紅四氮唑染色試驗不能產(chǎn)生有效染色反應(yīng),提示急性單側(cè)后肢缺血模型造模成功。1.3小鼠抗小鼠胞管相關(guān)因子的表達情況參照文獻,于術(shù)前及術(shù)后不同時間(1,7d,n=6;3d,n=10)采血,利用Histopaque-1083密度梯度離心獲取小細胞,調(diào)整細胞濃度為106/100μL,分別加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大鼠抗小鼠干細胞抗原-1(stemcellantigen-1,Sca-1)單克隆抗體、藻紅蛋白標(biāo)記的大鼠抗小鼠胎肝激酶1(fetalliverkinase-1,Flk-1)單克隆抗體、藻紅蛋白-花青苷5標(biāo)記的大鼠抗小鼠干細胞因子受體(cellular-kinaseintyrosine,c-Kit)單克隆抗體3種小鼠早期EPC表面標(biāo)記抗體或同型對照(Ebioscience公司),4℃避光孵育,孵育結(jié)束后采用FACSCalibur三色流式細胞儀(BD公司)檢測外周血單個核細胞中c-Kit+/Sca-1+/Flk-1+早期EPC比例,Cellquest軟件分析檢測結(jié)果。1.4骨髓沖洗方法于上述各時間點處死小鼠,參照文獻以外科手法暴露股骨及脛腓骨,剪去長骨骺端,開放骨髓腔,以300μL磷酸緩沖鹽水定量沖洗骨髓,離心后留取上清。ELISA法檢測血漿及骨髓上清中VEGF與SDF-1α水平,按照試劑盒(R&D公司)說明書進行操作。1.5pula擴增蛋白及抗氧化酶抑制劑的活性骨髓細胞沉淀經(jīng)Histopaque-1083密度梯度離心分離獲取單個核細胞。參照文獻,免疫印跡法測定骨髓單個核細胞中VEGF及其受體2(VEGFR2)、Akt、磷酸化Akt(Phospho-Akt)、eNOS、Phospho-eNOS、MMP-9及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinase,TIMP-1)蛋白表達水平。用含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的細胞裂解液提取細胞膜總蛋白,Bradford法定量。取100μg總蛋白變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,濕性電轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,轉(zhuǎn)移蛋白膜條以5%脫脂牛奶封閉后與相應(yīng)的一抗4℃過夜孵育[兔抗小鼠VEGFR2單克隆抗體1︰200(Millipore公司),羊抗小鼠VEGF多克隆抗體1︰400(SantaCruz公司),兔抗小鼠Akt及Phospho-Akt(Ser473)單克隆抗體1︰2000(Eptomics公司),小鼠抗小鼠eNOS及Phospho-eNOS(Ser1177)單克隆抗體1︰500(BD公司),兔抗小鼠MMP-9多克隆抗體1︰15000(Abcam公司),兔抗小鼠TIMP-1多克隆抗體1︰1000(Abcam公司),小鼠抗小鼠β-actin單克隆抗體1︰5000(BioVision公司)]。孵育結(jié)束后以PBST充分洗滌,之后與相應(yīng)的二抗室溫孵育2h。免疫反應(yīng)結(jié)束后ECL法顯影、洗片,用QuantityOne圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值,將待測蛋白條帶與同一泳道β-actin條帶光密度比值作為結(jié)果。1.6活性物質(zhì)的提取參照文獻,酶譜法測定骨髓MMP-9明膠酶活性。30μg骨髓上清蛋白在含有10%SDS和0.2%明膠的聚丙烯酰胺凝膠中電泳,將有活性的酶和無活性的酶原及內(nèi)源性組織抑制劑分離開來,膠原酶標(biāo)準(zhǔn)品(Chemicon公司)同步電泳以標(biāo)化,電泳完成后,以2.5%TritonX-100充分清洗去除SDS使酶恢復(fù)活性,之后在孵育液(50mmol/LTris,200mmol/LNaCl,5mmol/LCaCl2,1μmol/LZnCl2,1.5mmol/LNaN3,pH7.5)中37℃孵育36h使酶充分水解底物明膠,孵育結(jié)束后以0.1%考馬斯亮藍R-250室溫染色以顯示清晰的酶水解條帶,利用QuantityOne圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶反轉(zhuǎn)后的光密度值,作為酶活性強度。1.7連續(xù)變量的相關(guān)分析應(yīng)用SPASS11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較再用Bonferroni檢驗。兩個連續(xù)變量之間的相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)分析。以P<0.05(雙尾)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1各組小鼠體質(zhì)量和血糖比較入組時兩組小鼠體質(zhì)量與血糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后處死前,非糖尿病組小鼠體質(zhì)量較入組時增加(P<0.01),血糖無明顯變化。處死前,糖尿病組小鼠體質(zhì)量較非糖尿病組降低約20%(P<0.01),血糖較非糖尿病組明顯升高(P<0.01)。2.2急性術(shù)后兩組外周血早期epc水平比較在基礎(chǔ)狀態(tài)下,糖尿病組小鼠外周血c-Kit+/Sca-1+/Flk-1+早期EPC數(shù)量較非糖尿病組明顯減少。急性后肢缺血術(shù)后,非糖尿病組外周血早期EPC水平迅速增加,于術(shù)后3d達到高峰,之后逐漸下降,至術(shù)后7d接近基礎(chǔ)水平;而糖尿病組缺血誘導(dǎo)的骨髓EPC釋放曲線低平,術(shù)后3d時,其外周血早期EPC水平較非糖尿病組顯著減少[(0.97±0.18)%比(2.98±0.30)%,P<0.01]。2.3sdf-1時期與外周血早期EPC水平動態(tài)變化的趨勢一致,組織缺血后非糖尿病組血漿VEGF及SDF-1α水平均快速升高,于術(shù)后3d達到高峰[VEGF(164.1±30.4)比(54.5±20.8)ng/L,P<0.01;SDF-1α(1267±174)比(653±84)ng/L,P<0.01],之后VEGF水平迅速回落,SDF-1α則緩慢下降。而動員高峰期糖尿病組血漿VEGF及SDF-1α釋放水平與非糖尿病組比較明顯減低[VEGF(85.3±22.8)比(164.1±30.4)ng/L,P<0.01;SDF-1α:(731±52)比(1267±174)ng/L,P<0.01]。單變量回歸分析表明,在兩組動物,術(shù)后3d時其血漿SDF-1α水平與外周血EPC數(shù)量呈正相關(guān)(圖1D)。2.4各組小鼠骨髓vegf蛋白表達水平比較鑒于組織缺血后骨髓EPC動員的時間趨勢,我們重點對比觀察實驗動物在動員高峰期骨髓中相關(guān)信號分子的表達與活化。如圖2所示,非糖尿病組缺血后3d骨髓中SDF-1α及VEGF水平較非手術(shù)組明顯升高;而糖尿病組缺血術(shù)后骨髓中SDF-1α及VEGF的釋放水平較非糖尿病組明顯減低(圖2A、B,P<0.05)。蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示,術(shù)后3d非糖尿病組骨髓單個核細胞VEGF蛋白表達水平較非手術(shù)組明顯增加(圖2C,P<0.05)、其受體水平輕度上調(diào)(圖2D,P<0.05),并伴隨Akt及eNOS蛋白磷酸化增強(圖2E、F,P<0.05)。而糖尿病組缺血術(shù)后骨髓細胞VEGF及其受體表達上調(diào)受抑,且Akt及eNOS的磷酸化水平亦較非糖尿病組明顯減弱(P<0.05)。此外,缺血術(shù)后3d非糖尿病組骨髓細胞活性MMP-9蛋白表達水平(圖2G)以及骨髓上清MMP-9膠原酶活性(圖2H)較非手術(shù)組明顯增加(P<0.05),而TIMP-1蛋白表達水平輕度上調(diào)(圖2I)。糖尿病組缺血誘導(dǎo)的MMP-9蛋白表達及其酶活性較非糖尿病組顯著減低(P<0.05),而TIMP-1表達水平明顯增加(P<0.05)。單變量線性回歸分析表明,動員高峰期糖尿病組骨髓MMP-9酶活性受抑與其循環(huán)中EPC水平減低相關(guān)(圖2J,P<0.01)。3糖尿病動物活檢中vegf表達變化隨著骨髓起源EPC的發(fā)現(xiàn),人們逐漸認(rèn)識到出生后的血管新生不僅僅依賴于成熟血管內(nèi)皮細胞的分裂增殖,循環(huán)中骨髓起源的EPC可通過動員歸巢、分化增殖、遷移整合,以及旁分泌和自分泌等機制參與各種生理及病理狀態(tài)下的血管新生,因此,EPC的數(shù)量和功能將直接影響損傷血管的內(nèi)膜修復(fù)及反應(yīng)性血管新生。我們先前已觀察到糖尿病小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)下循環(huán)中早期EPC的數(shù)量就較非糖尿病動物明顯減少,其原因可能是糖尿病狀態(tài)下外周血EPC的生存時間縮短,抑或慢性內(nèi)皮損傷增加導(dǎo)致有限的骨髓EPC消耗性減少。此外,我們發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠缺血誘導(dǎo)的骨髓EPC向外周血動員存在明顯缺陷,這可能是阻礙糖尿病個體組織缺血損傷后血管新生及側(cè)支形成的重要原因,然而影響糖尿病骨髓EPC動員障礙的機制目前仍不清楚。循環(huán)中的EPC主要來源于骨髓。據(jù)Ceradini等報道,組織缺血缺氧發(fā)生后,損傷部位HIF-1α及SDF-1α生成增加。HIF-1α作為VEGF的轉(zhuǎn)錄活化因子,可刺激缺血組織表達與釋放VEGF。在骨髓組織中,增多的VEGF與骨髓細胞表面受體結(jié)合后進一步激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信號途徑,活化的蛋白激酶Akt誘導(dǎo)eNOS絲氨酸磷酸化,使eNOS酶活性增強,繼而一氧化氮合成與釋放增加。一氧化氮進而介導(dǎo)活性MMP-9釋放,后者水解骨髓基質(zhì)細胞表面的膜型Kit配體(mKitL)為可溶性的Kit配體(sKitL),促使c-Kit+干細胞及EPC在骨髓內(nèi)募集并向外周血遷移。此外,VEGF尚可以通過化學(xué)趨化、促增殖分化、調(diào)整血-骨髓屏障通透性等其他機制介導(dǎo)骨髓EPC動員。SDF-1α亦可通過PI3K/Akt/eNOS/MMP-9信號通路誘導(dǎo)VEGF合成、Akt/eNOS活化、一氧化氮及MMP-9生成增加,從而促進骨髓EPC動員、增強缺血組織的血管新生及血運重建。Kang等發(fā)現(xiàn),非糖尿病小鼠發(fā)生組織缺血后,其循環(huán)中早期EPC快速動員,同時伴有缺血組織HIF-1α及其下游信號分子白介素1β及VEGF的表達與釋放增加,并且組織及血漿VEGF水平與外周血早期EPC數(shù)量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果進一步顯示,缺血誘導(dǎo)的血漿SDF-1α釋放增加對骨髓EPC動員亦起到刺激作用。因此,我們認(rèn)為組織缺血可通過HIF-1α/SDF-1α/VEGF信號通路發(fā)揮促進骨髓EPC動員的作用。然而糖尿病動物缺血誘導(dǎo)的HIF-1α表達減少,SDF-1α及VEGF釋放顯著受抑,并伴隨循環(huán)中骨髓EPC水平明顯下降。結(jié)合國外研究我們認(rèn)為,糖尿病狀態(tài)下受抑的骨髓刺激與EPC動員障礙密切相關(guān)。最近Liu等報道,糖尿病小鼠缺血損傷發(fā)生后局部的SDF-1α釋放水平明顯減低,并伴隨骨髓中eNOS磷酸化受抑、一氧化氮生成減少,從而導(dǎo)致骨髓EPC動員及歸巢等功能障礙。同樣地,我們發(fā)現(xiàn),糖尿病小鼠缺血誘導(dǎo)的骨髓微環(huán)境中SDF-1α及VEGF釋放水平較非糖尿病組明顯減少,并且骨髓組織EPC動員相關(guān)的信號分子如VEGF及其受體2表達上調(diào)受抑、Akt與eN